Rinaturazione e ripiegamento delle proteine: l'esperimento di Anfinsen

Una proteina denaturata ha perso la forma, ma non l'informazione: la sua sequenza è intatta. La domanda allora è se quella sequenza basti, da sola, a far ritrovare alla catena la conformazione corretta. La risposta — in certe condizioni sì, in altre no — tocca uno dei problemi più profondi della biochimica: come una proteina si ripiega.

Questo articolo non si occupa di che cos'è la denaturazione e di quali agenti la provocano (le basi sono trattate a parte), ma del processo inverso: la rinaturazione, il ripiegamento e il perché spesso non riesce.

Denaturazione: il punto di partenza

Per inquadrare il discorso basta un richiamo. La denaturazione è la perdita della struttura nativa — secondaria, terziaria, quaternaria — senza rottura dei legami peptidici: la sequenza resta, il ripiegamento si disfa. La provocano calore, pH estremo, urea o guanidinio, detergenti, agenti riducenti. Tutto questo — definizione, agenti, perdita di funzione — è il presupposto di ciò che segue; per i dettagli rimandiamo all'articolo dedicato sulla denaturazione delle proteine. Qui partiamo da una proteina già srotolata e ci chiediamo: può tornare com'era?

L'esperimento di Anfinsen

La risposta storica venne da una serie di esperimenti sulla ribonucleasi A, un piccolo enzima di 124 residui stabilizzato da quattro ponti disolfuro. Trattandola con urea (che srotola la catena) e un agente riducente (che rompe i ponti disolfuro), l'enzima perde del tutto l'attività: è denaturato e ridotto a catena distesa. La sorpresa arriva rimuovendo lentamente i due reagenti: la proteina si ripiega da sola e recupera quasi per intero la sua attività catalitica, riformando spontaneamente i ponti disolfuro nelle posizioni corrette.

Il dato è impressionante se si pensa che, con otto cisteine, esistono numerose combinazioni di accoppiamento possibili e una sola è quella giusta: eppure la catena la ritrova. La conclusione è diventata un principio: la sequenza amminoacidica contiene tutta l'informazione necessaria a specificare la struttura tridimensionale. La forma nativa è quella termodinamicamente più stabile nelle condizioni fisiologiche, il minimo di energia verso cui la catena tende.

Il paradosso di Levinthal

Se però la sequenza determina la struttura, come fa la catena a trovarla? Un semplice conto mostra che non può farlo provando a caso. Una catena di un centinaio di residui ha un numero astronomico di conformazioni possibili: esplorarle tutte una a una richiederebbe tempi enormemente più lunghi dell'età dell'universo. Eppure molte proteine si ripiegano in frazioni di secondo. Questa contraddizione è il paradosso di Levinthal, e la sua soluzione è che il ripiegamento non è una ricerca casuale: segue percorsi guidati, in cui porzioni di struttura si formano presto e indirizzano il resto.

proteina denaturata (U) ⇌ proteina nativa (N)

Il ripiegamento è quindi descritto come un equilibrio fra lo stato disteso (U, unfolded) e quello nativo (N), spostato verso N nelle condizioni fisiologiche perché N ha l'energia libera più bassa.

L'imbuto di ripiegamento

L'immagine più utile è quella di un imbuto di energia: la catena distesa parte dall'alto, dove le conformazioni possibili sono moltissime e di energia simile, e scende verso il fondo, dove sta l'unica conformazione nativa di energia minima. Pareti dell'imbuto e piccoli avvallamenti laterali rappresentano gli intermedi e le trappole temporanee. Un intermedio tipico è il molten globule («globulo fuso»): una forma già compatta, con buona parte della struttura secondaria formata, ma con i contatti terziari ancora fluttuanti. Da lì la catena si assesta nella forma definitiva.

Quando la rinaturazione fallisce: l'aggregazione

In provetta la rinaturazione riesce facilmente solo in condizioni diluite e delicate. Il motivo è che la catena srotolata espone i residui idrofobici che normalmente stanno nascosti nel nucleo: se nelle vicinanze ci sono altre catene nelle stesse condizioni, questi residui tendono ad attaccarsi tra molecole diverse invece che ripiegarsi su sé stessi. Il risultato è l'aggregazione: ammassi disordinati e insolubili che precipitano e da cui non si torna indietro. È ciò che rende irreversibile la cottura dell'albume, ed è il problema numero uno quando si vuole recuperare una proteina attiva dai corpi di inclusione prodotti dai batteri in biotecnologia.

I chaperoni molecolari

Nella cellula il rischio di aggregazione è altissimo: l'ambiente è affollato e le proteine nascono distese dal ribosoma. Per questo esistono i chaperoni molecolari, proteine che assistono il ripiegamento altrui senza farne parte e senza dettarne la forma finale. Una prima famiglia, gli Hsp70 con i loro co-chaperoni Hsp40, lega le brevi tratte idrofobiche delle catene appena sintetizzate e le protegge dall'aggregazione finché non sono pronte a ripiegarsi. Una seconda classe, le chaperonine (come il sistema GroEL-GroES nei batteri), offre una vera e propria camera isolata in cui una singola catena può ripiegarsi al riparo dalle vicine. I chaperoni non violano il principio di Anfinsen: non aggiungono informazione, ma impediscono che la catena imbocchi vicoli ciechi.

La curva di fusione e la temperatura Tm

Il passaggio fra stato nativo e stato denaturato, al variare di temperatura o di concentrazione di denaturante, non è graduale ma brusco e cooperativo: la proteina resiste fino a una soglia, poi si srotola quasi tutta in un intervallo stretto, dando la classica curva a S. Il comportamento «tutto o niente» nasce dal fatto che le molte interazioni che tengono insieme lo stato nativo cedono insieme. La temperatura a cui metà delle molecole è denaturata è la temperatura di fusione (Tm), l'indice di stabilità più usato per confrontare proteine, mutanti o formulazioni: una Tm più alta significa una proteina più resistente.

Perché conta nella pratica

Il ripiegamento non è teoria astratta: è il cuore della produzione di proteine ricombinanti, dove spesso si deve far rinaturare una proteina recuperata in forma aggregata, e della formulazione dei farmaci biologici, dove la stabilità (misurata via Tm) decide la durata e le condizioni di conservazione. Gli errori di ripiegamento, inoltre, sono alla base di intere classi di patologie da aggregazione proteica. Capire perché una catena ritrova o non ritrova la sua forma è quindi un sapere molto concreto, ogni volta che una proteina deve restare attiva fuori dal suo ambiente naturale.

Domande frequenti

Che differenza c'è tra denaturazione e rinaturazione?

La denaturazione è la perdita della struttura nativa; la rinaturazione è il processo inverso, cioè il riacquisto spontaneo di quella struttura una volta rimosso l'agente denaturante. La rinaturazione riesce solo se la catena non si è nel frattempo aggregata in modo irreversibile.

Che cosa ha dimostrato l'esperimento di Anfinsen?

Che una proteina denaturata e ridotta (la ribonucleasi A) può ripiegarsi da sola e recuperare l'attività una volta rimossi i reagenti, riformando i ponti disolfuro corretti. La conclusione è che la sequenza amminoacidica contiene tutta l'informazione necessaria a specificare la struttura tridimensionale nativa.

Che cos'è il paradosso di Levinthal?

È l'osservazione che una proteina non può trovare la sua forma provando a caso tutte le conformazioni possibili, perché richiederebbe tempi lunghissimi, mentre in realtà si ripiega in tempi brevi. Se ne deduce che il ripiegamento segue percorsi guidati, non una ricerca casuale.

Perché in laboratorio la rinaturazione spesso fallisce?

Perché le catene srotolate espongono i residui idrofobici e, in soluzione concentrata, tendono ad aggregare tra molecole diverse invece di ripiegarsi su sé stesse. L'aggregato precipita e il processo diventa irreversibile. Per questo i protocolli di refolding usano condizioni molto diluite e delicate.

A che cosa servono i chaperoni molecolari?

Assistono il ripiegamento delle altre proteine impedendo l'aggregazione: legano le tratte idrofobiche esposte (Hsp70) o offrono una camera isolata in cui ripiegarsi (chaperonine come GroEL). Non cambiano la forma finale — che resta dettata dalla sequenza — ma evitano che la catena resti intrappolata in stati sbagliati.