Effetto del pH e della temperatura sugli enzimi

Un enzima lavora bene solo entro una finestra ristretta di pH e temperatura: fuori da quella finestra l’attività crolla, e oltre certi limiti la proteina si denatura in modo irreversibile. Conoscere l’optimum e le condizioni che lo distruggono è essenziale per ogni saggio enzimatico e per ogni processo biocatalitico.

Vediamo perché esiste un pH e una temperatura ottimali, che cosa succede oltre l’optimum, che cos’è la denaturazione e come queste dipendenze condizionano l’uso pratico degli enzimi.

L’optimum di temperatura

All’aumentare della temperatura la velocità di una reazione enzimatica cresce, come per ogni reazione: le molecole si muovono più in fretta e gli urti efficaci aumentano. Ma oltre una certa temperatura ottimale l’attività non sale più: comincia a crollare, perché il calore destabilizza la struttura tridimensionale della proteina. La curva attività-temperatura ha quindi una forma a campana: sale fino all’optimum e poi precipita.

La denaturazione

Il crollo oltre l’optimum di temperatura non è un semplice rallentamento: a temperature elevate l’enzima si denatura, cioè perde la sua struttura tridimensionale ripiegata. I legami deboli che tengono insieme la proteina (legami a idrogeno, interazioni idrofobiche, ponti salini) si rompono, la catena si srotola e il sito attivo si deforma. La denaturazione termica è quasi sempre irreversibile: una volta srotolata, la proteina di norma non si ripiega correttamente, e l’enzima è perso.

L’optimum di pH

Anche rispetto al pH l’attività enzimatica ha un andamento a campana, con un pH ottimale caratteristico. Il motivo è duplice. Primo, il pH determina lo stato di ionizzazione dei residui amminoacidici del sito attivo: molti meccanismi catalitici richiedono che certi gruppi siano protonati e altri deprotonati, e questo accade solo in un intervallo di pH. Secondo, valori di pH troppo estremi alterano le cariche su tutta la proteina, destabilizzandone la struttura fino alla denaturazione, anch’essa in genere irreversibile.

attività massima  →  al pH e alla temperatura ottimali (curva a campana)

Optimum diversi per enzimi diversi

L’optimum dipende dall’enzima e dall’ambiente in cui lavora in natura. La tabella mostra alcuni esempi illustrativi di pH ottimale, che riflettono il compartimento biologico di appartenenza.

Reversibile o irreversibile

Conviene distinguere due tipi di calo dell’attività in funzione delle condizioni. Spostamenti moderati di pH o piccole variazioni di temperatura attorno all’optimum producono un calo reversibile: l’enzima rallenta ma riprende la sua attività se le condizioni tornano ottimali, perché la struttura non è stata compromessa. Oltre certi limiti, invece, subentra la denaturazione, che nella maggior parte dei casi è irreversibile e distrugge definitivamente il sito attivo. In pratica, questo significa che un enzima esposto per errore a un pH estremo o a un picco di temperatura può essere perso anche se le condizioni vengono poi corrette: la perdita di funzione, una volta denaturata la proteina, non si recupera.

Altri fattori che destabilizzano

Pur essendo pH e temperatura i due fattori principali, altri agenti possono ridurre l’attività o denaturare un enzima e vanno controllati in laboratorio e nei processi. Tra i più rilevanti: i solventi organici e i detergenti, che disturbano le interazioni idrofobiche; gli agenti caotropici come l’urea, che destabilizzano il ripiegamento; gli ioni di metalli pesanti, che possono legarsi a gruppi essenziali del sito attivo; l’agitazione meccanica troppo vigorosa, che può denaturare le proteine all’interfaccia con l’aria. Una corretta conservazione (al freddo, in tampone adatto, talvolta con stabilizzanti) preserva l’attività nel tempo. Anche la forza ionica del mezzo influenza la stabilità, perché incide sui ponti salini che tengono insieme la struttura.

Perché conta nella pratica

pH e temperatura sono le prime variabili da controllare in qualsiasi uso di un enzima. In un saggio enzimatico vanno tenuti all’optimum e tamponati con cura, altrimenti i dati cinetici non sono confrontabili e si rischia di misurare la denaturazione invece dell’attività. Nella biocatalisi industriale e nelle formulazioni con enzimi (detergenti, alimenti, diagnostica) la finestra di stabilità determina le condizioni di processo, la conservazione e la durata del prodotto. Capire dove sta l’optimum e che cosa lo distrugge è il primo requisito per lavorare con gli enzimi.

Domande frequenti

Perché esiste una temperatura ottimale per un enzima?

Perché due effetti opposti si bilanciano. All’aumentare della temperatura la velocità della reazione cresce, come per ogni reazione; ma oltre un certo punto il calore destabilizza la struttura della proteina e la denatura, facendo crollare l’attività. Il risultato è una curva a campana con un massimo alla temperatura ottimale, oltre la quale l’enzima perde rapidamente funzione.

Che cos’è la denaturazione di un enzima?

È la perdita della struttura tridimensionale nativa della proteina, e quindi della sua funzione. Avviene per temperatura elevata, pH estremi o altri agenti che rompono i legami deboli (legami a idrogeno, interazioni idrofobiche, ponti salini) che ne mantengono il ripiegamento. Il sito attivo si deforma e l’enzima diventa inattivo. La denaturazione termica è di solito irreversibile.

Perché il pH influenza l’attività enzimatica?

Per due motivi. Il pH determina lo stato di ionizzazione dei residui amminoacidici del sito attivo, e molti meccanismi catalitici richiedono che certi gruppi siano protonati e altri no, condizione che si verifica solo in un intervallo ristretto. Inoltre valori di pH troppo estremi alterano le cariche sull’intera proteina e la denaturano. Ne risulta una curva di attività a campana con un pH ottimale.

Tutti gli enzimi hanno lo stesso pH ottimale?

No, dipende dall’ambiente in cui ciascun enzima lavora in natura. La pepsina dello stomaco ha optimum molto acido (circa 2), molti enzimi citosolici lavorano attorno a pH 7, la tripsina intestinale attorno a pH 8 e la fosfatasi alcalina in ambiente basico. Ogni enzima è adattato al compartimento biologico in cui opera, e fuori da quella finestra di pH la sua attività cala.

Come resistono al calore gli enzimi dei termofili?

Gli enzimi dei microrganismi termofili hanno strutture più stabili, con più legami stabilizzanti, che resistono a temperature che denaturerebbero gli enzimi ordinari. Per questo hanno optimum di temperatura molto alti. Un esempio è la DNA polimerasi termostabile usata nella PCR, la cui resistenza al calore ha reso possibile l’amplificazione automatizzata del DNA. La stabilità termica è una proprietà molto ricercata nella biocatalisi.