Accoppiamento GC-MS e LC-MS: separare e identificare

Uno spettrometro di massa diventa enormemente più potente quando è preceduto da una tecnica di separazione: la cromatografia distribuisce nel tempo le sostanze di una miscela, e la massa le identifica e quantifica una per una. L’accoppiamento GC-MS (con la gascromatografia) e LC-MS (con la cromatografia liquida) è oggi lo strumento di riferimento dei laboratori di controllo qualità, ambientali e clinici.

Vediamo perché conviene accoppiare separazione e spettrometria, come funziona l’interfaccia GC-MS, quali sono le sorgenti dell’LC-MS (ESI e APCI) e dove si usano queste piattaforme.

Perché accoppiare separazione e massa

La spettrometria di massa identifica una sostanza, ma su una miscela complessa lo spettro diventa una sovrapposizione confusa di molti componenti. Separando prima le sostanze nel tempo con la cromatografia, ogni composto arriva all’analizzatore da solo, in un momento diverso: lo spettro di massa è pulito e l’identificazione affidabile. In più, il tempo di ritenzione cromatografico aggiunge una seconda informazione di conferma. La massa, dal canto suo, fornisce alla cromatografia un rivelatore estremamente specifico e sensibile.

L’interfaccia GC-MS

Nel GC-MS la sfida è il vuoto. La gascromatografia separa composti volatili e termicamente stabili trasportati da un gas (di solito elio), ma lo spettrometro lavora sotto vuoto spinto: bisogna far entrare il campione eliminando il grosso del gas di trasporto. Con le moderne colonne capillari, che hanno portate molto basse, il problema si è semplificato al punto che spesso la colonna entra quasi direttamente nella sorgente, dove gli analiti vengono ionizzati per impatto elettronico (EI). L’EI dà spettri ricchi di frammenti e altamente riproducibili, confrontabili con librerie standardizzate per l’identificazione.

L’interfaccia LC-MS: ESI e APCI

L’accoppiamento con la cromatografia liquida è stato per anni il problema più difficile: bisognava trasformare in ioni gassosi sostanze disciolte in un solvente, spesso termolabili e non volatili, senza distruggerle e senza inondare il vuoto di vapore. La svolta è venuta dalle sorgenti a pressione atmosferica, dove la ionizzazione avviene fuori dal vuoto e solo gli ioni vengono poi aspirati nell’analizzatore. Le due principali sono l’elettrospray (ESI) e la ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI).

colonna (separazione nel tempo)  →  sorgente (ionizzazione)  →  analizzatore (m/z)  →  rivelatore

L’elettrospray è la sorgente dominante dell’LC-MS: nebulizza la soluzione in goccioline cariche da cui emergono ioni, ed è ideale per molecole polari e per le grandi biomolecole. Una sua caratteristica peculiare è la produzione di ioni a carica multipla: una proteina può acquisire molte cariche, e poiché l’analizzatore misura m/z, lo ione cade a un m/z basso e accessibile anche per masse molto elevate. L’APCI, invece, è più adatta a molecole di media polarità e meno termolabili. Dettagli e meccanismi di ESI, APCI e MALDI sono nel cluster sulle tecniche di ionizzazione.

GC-MS e LC-MS a confronto

Le due piattaforme si dividono il mondo delle molecole.

Dove si usano

Il GC-MS è la spina dorsale dell’analisi ambientale dei composti volatili e semivolatili (solventi, idrocarburi, pesticidi clorurati), dell’analisi di aromi e fragranze, della tossicologia forense. L’LC-MS domina invece il farmaceutico, la diagnostica clinica, l’analisi di residui e contaminanti polari negli alimenti, la proteomica e la metabolomica. In quasi tutti questi campi il rivelatore di scelta per la quantificazione è il triplo quadrupolo in MRM, mentre per lo screening esteso e l’identificazione di ignoti si usano gli analizzatori ad alta risoluzione (TOF, Orbitrap).

Perché conta nella pratica

Sapere quando scegliere GC-MS e quando LC-MS è una delle decisioni metodologiche più frequenti in laboratorio, e dipende dalla natura dell’analita: volatile e apolare verso il GC-MS, polare o termolabile verso l’LC-MS. Capire come le interfacce risolvono il problema del vuoto e della ionizzazione, e perché l’EI è confrontabile con le librerie mentre l’ESI di solito richiede l’MS/MS, permette di impostare metodi affidabili e di interpretare correttamente i risultati nei controlli ambientali, alimentari, farmaceutici e clinici.

Domande frequenti

Perché si accoppia la cromatografia alla spettrometria di massa?

Perché su una miscela complessa lo spettro di massa diventa una sovrapposizione confusa di molti componenti. Separando prima le sostanze nel tempo con la cromatografia, ogni composto entra nell’analizzatore da solo e produce uno spettro pulito e identificabile. In più il tempo di ritenzione aggiunge un’informazione di conferma e la massa fornisce alla cromatografia un rivelatore molto specifico e sensibile.

Come si risolve il problema del vuoto nel GC-MS?

La gascromatografia usa un gas di trasporto, mentre lo spettrometro lavora sotto vuoto spinto. Con le moderne colonne capillari, a portata molto bassa, il carico di gas è gestibile dal sistema di pompaggio e spesso la colonna entra quasi direttamente nella sorgente, dove gli analiti vengono ionizzati per impatto elettronico. Le colonne capillari hanno reso l’accoppiamento GC-MS semplice e diffuso.

Quali sorgenti si usano in LC-MS?

Soprattutto le sorgenti a pressione atmosferica: l’elettrospray (ESI) e la ionizzazione chimica a pressione atmosferica (APCI). La ionizzazione avviene fuori dal vuoto e solo gli ioni vengono aspirati nell’analizzatore, evitando di inondarlo di vapore. L’ESI è ideale per molecole polari e grandi biomolecole, l’APCI per molecole di media polarità e meno termolabili.

Perché l’elettrospray produce ioni a carica multipla?

Perché nel processo di nebulizzazione una molecola può acquisire più cariche contemporaneamente, specie se ha molti siti ionizzabili come una proteina. Poiché l’analizzatore misura il rapporto massa/carica, un alto numero di cariche fa cadere lo ione a un m/z basso e misurabile anche per masse molto elevate. È ciò che permette all’LC-MS di analizzare macromolecole con analizzatori dall’intervallo di m/z modesto.

Quando scegliere GC-MS e quando LC-MS?

Dipende dall’analita: il GC-MS è adatto a composti volatili e termicamente stabili, tipicamente apolari (solventi, pesticidi, composti organici volatili); l’LC-MS a composti polari, termolabili o non volatili in soluzione (farmaci, peptidi, metaboliti). Se la sostanza non è volatilizzabile senza degradarsi, la scelta cade sull’LC-MS; se è volatile e dà buoni spettri EI, sul GC-MS.