L’analizzatore a tempo di volo (TOF) e il reflectron

L’analizzatore a tempo di volo (TOF) separa gli ioni con un’idea elegante e semplice: dopo averli accelerati tutti con la stessa energia, misura quanto tempo impiegano a percorrere un tubo. Gli ioni leggeri arrivano prima, i pesanti dopo. Senza parti in scansione, il TOF registra uno spettro completo in microsecondi e copre intervalli di massa enormi, fino alle macromolecole.

Vediamo come la separazione avviene per tempo di volo, perché il reflectron migliora la risoluzione, quali sono i punti di forza del TOF e dove si usa.

La separazione per tempo di volo

Il principio è diretto. Tutti gli ioni vengono accelerati attraverso la stessa differenza di potenziale, acquistando così la stessa energia cinetica. Ma a parità di energia, la velocità dipende dalla massa: gli ioni leggeri vanno più veloci, i pesanti più lenti. Lasciandoli volare in un tubo privo di campi (la regione di drift), il tempo di arrivo al rivelatore diventa una misura diretta del rapporto m/z. Più precisamente, il tempo di volo è proporzionale alla radice quadrata di m/z.

½ m v² = z e V  ⇒  t ∝ √(m/z)  (ioni leggeri prima, pesanti dopo)

Il problema della dispersione di energia

Nella pratica gli ioni dello stesso m/z non partono mai esattamente con la stessa energia cinetica: c’è una piccola dispersione, dovuta alla posizione e al momento in cui vengono formati o estratti. Due ioni identici con energie leggermente diverse arrivano al rivelatore in istanti diversi, e questo allarga i picchi, peggiorando la risoluzione. Il TOF lineare «puro» soffre molto di questo problema.

Il reflectron

La soluzione è il reflectron, uno specchio elettrostatico posto in fondo al tubo. È una regione con un campo elettrico che respinge gli ioni e li rimanda indietro verso un secondo rivelatore. Il trucco è questo: un ione più energetico penetra più a fondo nello specchio e quindi impiega un po’ più di tempo a essere respinto; uno meno energetico penetra meno e torna prima. Lo specchio compensa così la dispersione di energia, facendo arrivare gli ioni dello stesso m/z tutti nello stesso istante. Il risultato è un netto aumento del potere risolutivo. Il TOF con specchio si chiama reTOF.

I punti di forza del TOF

Le caratteristiche che rendono il TOF prezioso derivano direttamente dal suo principio.

Dove si usa il TOF

Il TOF è l’analizzatore di elezione per il MALDI, perché entrambi lavorano a impulsi: il laser genera pacchetti di ioni e il TOF li misura uno «sparo» alla volta. È larghissimamente usato in proteomica e nello studio di grandi biomolecole. Con l’accelerazione ortogonale il TOF si è poi sposato anche con sorgenti continue come l’elettrospray, dando origine agli ibridi quadrupolo-TOF (Q-TOF) di cui parleremo nel tandem. La rapidità lo rende inoltre ideale come secondo analizzatore quando serve registrare spettri completi ad alta velocità.

Perché conta nella pratica

Il TOF è la scelta naturale quando servono ampio intervallo di massa, alta velocità e buona risoluzione insieme: identificazione di proteine, screening rapido, analisi non mirate (untargeted) in cui si registra «tutto» per poi interrogarlo a posteriori. Capire perché serve il reflectron e che cosa si guadagna o si perde con le diverse geometrie aiuta a leggere le specifiche e a scegliere fra un TOF e altri analizzatori a seconda che la priorità sia la quantificazione mirata o l’esplorazione completa di un campione.

Domande frequenti

Come separa gli ioni un analizzatore a tempo di volo?

Accelera tutti gli ioni con la stessa energia cinetica e poi misura il tempo che impiegano a percorrere un tubo privo di campi. A parità di energia, gli ioni leggeri sono più veloci e arrivano prima, i pesanti più lenti e arrivano dopo. Il tempo di volo, proporzionale alla radice quadrata di m/z, viene convertito direttamente nel valore di massa/carica.

A che cosa serve il reflectron?

A correggere la dispersione di energia cinetica degli ioni, che altrimenti allargherebbe i picchi. È uno specchio elettrostatico in cui gli ioni più energetici penetrano più a fondo e impiegano più tempo a essere respinti, mentre i meno energetici tornano prima. Così gli ioni dello stesso m/z arrivano al rivelatore insieme, aumentando nettamente il potere risolutivo dello strumento.

Perché il TOF è adatto al MALDI?

Perché entrambi lavorano a impulsi: il laser MALDI genera pacchetti discreti di ioni e il TOF li misura uno «sparo» alla volta, registrando l’intero spettro per ogni impulso. Inoltre il TOF copre intervalli di massa enormi, adatti alle grandi biomolecole prodotte dal MALDI. È per questo l’accoppiamento di riferimento in proteomica e nello studio delle macromolecole.

Il TOF può lavorare con sorgenti continue come l’elettrospray?

Sì, grazie all’accelerazione ortogonale: il flusso continuo di ioni viene «affettato» in pacchetti spingendoli perpendicolarmente nel tubo di volo. Questo ha permesso di accoppiare il TOF con l’elettrospray e di costruire strumenti ibridi quadrupolo-TOF (Q-TOF), molto usati per misure accurate di massa su campioni separati in cromatografia liquida.

Qual è il limite del TOF lineare semplice?

La risoluzione limitata, dovuta alla dispersione di energia cinetica degli ioni di uguale m/z: partendo con energie leggermente diverse, arrivano al rivelatore in istanti diversi e i picchi si allargano. Il reflectron risolve in gran parte il problema; per questo gli strumenti a buona risoluzione sono quasi sempre reTOF e il TOF lineare puro si usa solo per masse molto elevate.