Biochimica
Le molecole della vita e i processi biochimici, con uno sguardo a cosmetica e biocidi.
In sintesi
- È la concentrazione di substrato a cui la velocità enzimatica è metà della velocità massima Vmax.
- Vmax dipende dalla concentrazione totale di enzima usata nell’esperimento; kcat (= Vmax/[E]T) è una costante intrinseca dell’enzima, indipendente dalla sua concentrazione.
- Perché la curva iperbolica si avvicina a Vmax in modo asintotico, rendendo difficile la stima diretta.
- Misura l’efficienza catalitica a basse concentrazioni di substrato, cioè nel regime in cui [S] « KM.
Un enzima e il suo substrato non si legano e basta: tra loro si instaura una coreografia precisa di formazione e decomposizione del complesso, governata da leggi quantitative. L’equazione di Michaelis-Menten è la formula che condensa questo comportamento in pochi parametri misurabili — ed è ancora oggi, a più di cento anni dalla sua derivazione, il fondamento dell’analisi cinetica enzimatica.
In questo articolo deriviamo l’equazione partendo dal meccanismo a due tappe, discutiamo il significato fisico di KM e Vmax, introduciamo la costante catalitica kcat e il rapporto di efficienza kcat/KM, e vediamo come il grafico dei doppi reciproci permette di ricavare questi parametri dai dati sperimentali.
Il meccanismo di base: E + S ⇌ ES → E + P
Intorno al 1902, il chimico Adrian Brown studiò l’idrolisi del saccarosio e osservò qualcosa di insolito: ad alte concentrazioni di substrato la velocità non aumentava più, rimanendo costante. Propose allora che la reazione passasse per un intermedio enzima-substrato (ES). Il modello formale si scrive:
E + S ⇌ ES → E + P
Le costanti di velocità k1 e k−1 governano la formazione e la dissociazione di ES; k2 è la costante di formazione del prodotto. Nel 1913 Leonor Michaelis e Maud Menten ipotizzarono che il primo equilibrio fosse molto rapido rispetto alla seconda tappa (k−1 » k2). Nel 1925 Briggs e Haldane formularono la condizione più generale dello stato stazionario: la concentrazione del complesso ES resta approssimativamente costante nel tempo, cioè la sua velocità di formazione eguaglia quella di scomparsa.
L’equazione di Michaelis-Menten
Imponendo la condizione di stato stazionario e usando la concentrazione totale di enzima [E]T = [E] + [ES] come grandezza misurabile, si arriva all’equazione fondamentale:
v₀ = Vmax [S]KM + [S]
Vmax = k2 [E]T è la velocità massima, raggiunta quando l’enzima è completamente saturo (tutto in forma ES). KM = (k−1 + k2) / k1 è la costante di Michaelis, con dimensioni di concentrazione. Quando [S] = KM si ricava v₀ = Vmax/2: KM è quindi la concentrazione di substrato a cui la velocità è metà del massimo.
Significato fisico di KM
KM non è semplicemente una costante di dissociazione: è un parametro composito. Tuttavia, quando k2 « k−1, KM si avvicina alla costante di dissociazione KS del complesso ES, e diventa una misura dell’affinità dell’enzima per il substrato. Un KM basso indica alta affinità: l’enzima è già quasi saturo a basse concentrazioni di substrato. Un KM alto indica bassa affinità: occorrono concentrazioni elevate per avvicinarsi alla Vmax.
I valori di KM per gli enzimi fisiologici ricadono tipicamente nell’intervallo 10−7–10−1 M, con la maggioranza nel range millimolare — non a caso simile alle concentrazioni intracellulari dei substrati comuni, il che suggerisce che in vivo molti enzimi operano a concentrazioni di substrato vicine al loro KM, in una zona in cui la velocità è sensibile alle fluttuazioni di [S]: è questa sensibilità che consente la regolazione fine del metabolismo.
La costante catalitica kcat e il numero di turnover
kcat = Vmax[E]T kcat/KM = efficienza catalitica
kcat, detto numero di turnover, è il numero di molecole di substrato che ogni sito attivo converte in prodotto per unità di tempo quando l’enzima è completamente saturo. I valori tabulati mostrano una variazione enorme: l’anidrasi carbonica raggiunge circa 106 s−1 (converte un milione di molecole di CO2 al secondo per sito attivo), mentre la chimotripsina è molto più lenta, con kcat di 10−100 s−1 a seconda del substrato.
Dati di KM, kcat e kcat/KM per enzimi noti
La tabella seguente riporta valori reali che illustrano la variabilità dei parametri cinetici tra enzimi diversi:
| Enzima | Substrato | KM (M) | kcat (s−1) | kcat/KM (M−1∙s−1) |
|---|---|---|---|---|
| Acetilcolina esterasi | Acetilcolina | 9,5 × 10−5 | 1,4 × 104 | 1,5 × 108 |
| Anidrasi carbonica | CO2 | 1,2 × 10−2 | 1,0 × 106 | 8,3 × 107 |
| Catalasi | H2O2 | 2,5 × 10−2 | 1,0 × 107 | 4,0 × 108 |
| Chimotripsina | N-acetiltirosina etilestere | 6,6 × 10−4 | 190 | 2,9 × 105 |
| Fumarasi | Fumarato | 5,0 × 10−6 | 800 | 1,6 × 108 |
| Ureasi | Urea | 2,5 × 10−2 | 1,0 × 104 | 4,0 × 105 |
Il grafico di Lineweaver-Burk
Ricavare Vmax e KM dal grafico diretto v vs [S] è difficile perché la curva si avvicina asintoticamente a Vmax. Il metodo più classico è il grafico di Lineweaver-Burk (doppi reciproci): prendendo il reciproco di entrambi i termini dell’equazione di Michaelis-Menten si ottiene una retta:
1v₀ = KMVmax ∙ 1[S] + 1Vmax
La pendenza vale KM/Vmax; l’intercetta sull’asse y vale 1/Vmax; l’intercetta sull’asse x vale −1/KM. Basta una regressione lineare per estrarre entrambi i parametri. Questo grafico è fondamentale anche per diagnosticare i tipi di inibizione enzimatica, come vedremo nell’articolo dedicato.
Domande frequenti
Che cos’è la costante di Michaelis KM?
È la concentrazione di substrato a cui la velocità enzimatica è metà della velocità massima Vmax. Nella condizione in cui k2 « k−1, KM approssima la costante di dissociazione del complesso enzima-substrato, ed è quindi una misura inversa dell’affinità: KM bassa = alta affinità.
Che differenza c’è tra Vmax e kcat?
Vmax dipende dalla concentrazione totale di enzima usata nell’esperimento; kcat (= Vmax/[E]T) è una costante intrinseca dell’enzima, indipendente dalla sua concentrazione. kcat esprime il numero di cicli catalitici per sito attivo al secondo a saturazione di substrato.
Perché si usa il grafico di Lineweaver-Burk?
Perché la curva iperbolica si avvicina a Vmax in modo asintotico, rendendo difficile la stima diretta. Il doppio reciproco trasforma l’iperbole in una retta da cui si estraggono KM e Vmax per regressione lineare. Ha uno svantaggio: i punti a bassa [S] (grandi valori di 1/[S]) sono molto distanziati e pesano in modo sproporzionato sul fit.
Cosa indica il rapporto kcat/KM?
Misura l’efficienza catalitica a basse concentrazioni di substrato, cioè nel regime in cui [S] « KM. È la costante di velocità apparente di secondo ordine della reazione E + S → E + P e tiene conto sia della velocità di formazione del prodotto (kcat) sia dell’affinità per il substrato (1/KM). Il limite fisico è la velocità di diffusione.
L’equazione di Michaelis-Menten vale sempre?
Non sempre. È derivata ipotizzando un solo substrato, assenza di inibizione da prodotto, assenza di cooperatività e stato stazionario. Per gli enzimi allosterici (cooperativi) si usa l’equazione di Hill. Per più substrati esistono estensioni più complesse. Tuttavia il modello di Michaelis-Menten rimane il punto di partenza universale dell’analisi cinetica enzimatica.
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Avvertenza. Questo articolo ha finalità informative e divulgative e riflette la normativa vigente alla data di pubblicazione; le scadenze indicate possono essere modificate da provvedimenti successivi. Non sostituisce la verifica tecnica del singolo prodotto e del caso specifico. A cura della Redazione di ChimicaConforme.