Enzimi di restrizione e biotecnologie: tagliare e clonare il DNA

Per studiare e manipolare il DNA servono strumenti capaci di tagliarlo in punti precisi. La natura li ha già inventati: sono gli enzimi di restrizione, proteine batteriche che riconoscono brevi sequenze e tagliano il DNA esattamente lì. La loro scoperta ha dato il via all’ingegneria genetica e a buona parte delle moderne biotecnologie.

Vediamo come funzionano gli enzimi di restrizione, perché le estremità che producono sono così utili, come si usano per clonare un gene e che cosa fa, in modo complementare, la PCR.

Che cosa sono gli enzimi di restrizione

Gli enzimi di restrizione (o endonucleasi di restrizione) sono enzimi batterici che tagliano il DNA in corrispondenza di sequenze specifiche, dette siti di restrizione, lunghe in genere da quattro a otto basi. Nei batteri svolgono una funzione difensiva: tagliano e distruggono il DNA dei virus invasori, mentre il DNA proprio è protetto da modifiche chimiche.

La caratteristica più utile è la loro precisione: ogni enzima riconosce una sequenza ben definita e taglia sempre nello stesso punto. Le sequenze riconosciute sono spesso palindromiche, cioè si leggono uguali nei due filamenti, da capo a coda nel verso 5’→3′.

5′-G A A T T C-3′
3′-C T T A A G-5′  →  taglio nel sito palindromico (EcoRI)

L’enzima EcoRI, per esempio, riconosce la sequenza GAATTC e taglia tra la G e la A su entrambi i filamenti. Poiché il taglio è sfalsato, lascia brevi tratti a singolo filamento.

Estremità coesive ed estremità piatte

A seconda di come tagliano, gli enzimi di restrizione producono due tipi di estremità. Alcuni tagliano i due filamenti in posizioni sfalsate, lasciando brevi sporgenze a singolo filamento: sono le estremità coesive (sticky ends). Altri tagliano i due filamenti alla stessa altezza, lasciando estremità piatte (blunt ends).

Le estremità coesive sono preziose perché le sporgenze possono appaiarsi con qualunque altro frammento tagliato dallo stesso enzima, comprese sequenze di origine diversa. È questo che permette di unire, per esempio, un gene umano a un DNA batterico: si tagliano entrambi con lo stesso enzima e le estremità complementari si appaiano. La DNA ligasi salda poi i frammenti, creando una molecola di DNA ricombinante.

Il clonaggio di un gene

Mettendo insieme questi strumenti si arriva al clonaggio, cioè alla produzione di molte copie identiche di un gene. Il procedimento classico prevede pochi passaggi: si taglia con un enzima di restrizione sia il gene di interesse sia un vettore (spesso un plasmide, un piccolo anello di DNA batterico); si uniscono i due frammenti con la DNA ligasi, ottenendo un plasmide ricombinante; si introduce il plasmide in cellule batteriche; e si lasciano moltiplicare i batteri, che replicano il plasmide a ogni divisione.

Il risultato è una popolazione di batteri che contengono e copiano il gene di interesse: una «fotocopiatrice» vivente. Così si producono, su scala industriale, proteine utili come l’insulina umana, fabbricata proprio da batteri ingegnerizzati a partire dagli anni Ottanta.

Cenni di PCR: amplificare senza cellule

Accanto al clonaggio nei batteri esiste un metodo per moltiplicare il DNA in provetta, senza cellule: la reazione a catena della polimerasi (PCR). La PCR sfrutta una DNA polimerasi resistente al calore e cicli ripetuti di temperatura. In ogni ciclo il DNA viene denaturato (separato in due filamenti scaldando), si fanno appaiare brevi inneschi (primer) che delimitano la regione da copiare, e la polimerasi sintetizza i nuovi filamenti.

Poiché il numero di copie raddoppia a ogni ciclo, in poche ore si ottengono milioni di copie di un tratto di DNA partendo da pochissimo materiale. La PCR è oggi alla base di moltissime applicazioni: diagnosi di malattie, test genetici, identificazione forense e rilevamento di agenti patogeni. Insieme agli enzimi di restrizione e alla ligasi, costituisce la cassetta degli attrezzi di base della biologia molecolare applicata.

Gli strumenti del DNA ricombinante

I principali strumenti usati per manipolare il DNA e il loro ruolo:

Combinati, questi strumenti permettono di isolare, copiare e trasferire geni: è la base concreta dell’ingegneria genetica e delle biotecnologie moderne.

Vedi anche. Lo strumento che amplifica un tratto di DNA fino a miliardi di copie è la PCR, spiegata passo per passo.

Vedi anche. Lo strumento che oggi permette di modificare il DNA in un punto preciso è CRISPR-Cas9.

Domande frequenti

Che cosa sono gli enzimi di restrizione?

Sono enzimi batterici che riconoscono brevi sequenze specifiche di DNA, dette siti di restrizione, e le tagliano sempre nello stesso punto. Nei batteri difendono dai virus; in laboratorio servono a tagliare il DNA in modo preciso e controllato.

Che cosa sono le estremità coesive?

Sono le sporgenze a singolo filamento lasciate dagli enzimi che tagliano i due filamenti in posizioni sfalsate. Poiché sono complementari, possono appaiarsi con qualsiasi altro frammento tagliato dallo stesso enzima, anche di origine diversa: è così che si crea il DNA ricombinante.

Che cos’è il clonaggio di un gene?

È la produzione di molte copie identiche di un gene. Si inserisce il gene in un vettore (di solito un plasmide), lo si introduce in batteri e si lasciano moltiplicare: a ogni divisione i batteri copiano anche il gene. Così si producono, ad esempio, proteine farmaceutiche come l’insulina.

A che cosa serve la PCR?

La reazione a catena della polimerasi amplifica un tratto di DNA in provetta, producendo milioni di copie in poche ore a partire da pochissimo materiale. È usata per diagnosi, test genetici, indagini forensi e rilevamento di patogeni.

Qual è la differenza tra clonaggio e PCR?

Il clonaggio copia il DNA dentro cellule viventi (batteri che replicano un plasmide), mentre la PCR lo copia in provetta, senza cellule, mediante cicli termici e una polimerasi resistente al calore. Sono approcci complementari per moltiplicare il DNA.