Chimica analitica e di laboratorio
Tecniche di laboratorio e controllo qualita’: cromatografia, spettroscopia, titolazioni.
In sintesi
- La retta di taratura collega assorbanza e concentrazione per una serie di soluzioni standard a composizione nota.
- La deviazione dalla linearità si manifesta tipicamente ad alta concentrazione (A > 1).
- Con la concentrazione in mol·L−1 e il cammino ottico in cm, ε ha unità L·mol−1·cm−1.
- Si sceglie la lunghezza d’onda corrispondente al massimo di assorbimento (λmax) della specie da determinare.
La spettrofotometria UV-Vis è la tecnica di analisi quantitativa più usata in laboratorio chimico, biologico e ambientale. La legge di Lambert-Beer A = ε·b·c lega in modo lineare l’assorbanza di una soluzione alla concentrazione della specie assorbente. Questi sei esercizi svolti coprono i passi fondamentali: conversione trasmittanza-assorbanza, applicazione diretta della legge di Beer, calcolo di ε, costruzione e uso della retta di taratura, correzione per la diluizione e analisi di una miscela a due componenti. Ogni soluzione è sviluppata passo per passo con i calcoli eseguiti esplicitamente.
Esercizio 1 — Da trasmittanza ad assorbanza e viceversa
Una soluzione colorata a 525 nm presenta una trasmittanza T = 0,40. Calcola la corrispondente assorbanza. Calcola poi l’assorbanza di una soluzione con T = 0,75 e, infine, ricava la trasmittanza di un campione la cui assorbanza vale A = 0,850.
| Trasmittanza (caso a) | T = 0,40 |
|---|---|
| Trasmittanza (caso b) | T = 0,75 |
| Assorbanza (caso c) | A = 0,850 |
| Definizione | A = −log10(T) |
Soluzione passo per passo
La trasmittanza esprime la frazione di luce che attraversa il campione; l’assorbanza è il suo logaritmo in base 10 cambiato di segno. Le due grandezze si convertono con:
A = −log10(T) ⇔ T = 10−A
Caso a — T = 0,40:
A = −log10(0,40) = 0.3979
Caso b — T = 0,75:
A = −log10(0,75) = 0.1249
Caso c — A = 0,850: si inverte la relazione.
T = 10−0,850 = 0.1413
Esercizio 2 — Legge di Beer: calcolo di A e di c
Il permanganato di potassio (KMnO4) a 525 nm ha un coefficiente di estinzione molare ε = 5200 L·mol−1·cm−1. Usa una cuvetta da 1,00 cm. (a) Calcola l’assorbanza di una soluzione 3,50×10−5 mol/L. (b) Determina la concentrazione di una soluzione che presenta A = 0,468.
| ε (KMnO4, 525 nm) | 5200 L·mol−1·cm−1 |
|---|---|
| Cammino ottico b | 1,00 cm |
| Concentrazione (caso a) | c = 3,50×10−5 mol/L |
| Assorbanza (caso b) | A = 0,468 |
Soluzione passo per passo
La legge di Lambert-Beer afferma che l’assorbanza è proporzionale sia alla concentrazione sia al cammino ottico:
A = ε · b · c
Con ε espresso in L·mol−1·cm−1, b in cm e c in mol·L−1, A è adimensionale.
Caso a — calcolo di A:
A = 5200 × 1,00 × 3,50×10−5 = 0.182
Caso b — dalla legge di Beer si ricava c = A / (ε·b):
c = Aε · b = 0,4685200 × 1,00 = 9×10-5 mol/L
Esercizio 3 — Calcolo del coefficiente di estinzione molare ε
Una soluzione di colorante sintetico a 470 nm, di concentrazione 3,60×10−5 mol/L, posta in una cuvetta di 2,00 cm di cammino ottico, assorbe con A = 0,374. Determina il coefficiente di estinzione molare ε e discuti il suo significato fisico.
| Assorbanza A | 0,374 |
|---|---|
| Cammino ottico b | 2,00 cm |
| Concentrazione c | 3,60×10−5 mol/L |
Soluzione passo per passo
Invertendo la legge di Beer si ricava direttamente ε:
ε = Ab · c
ε = 0,3742,00 × 3,60×10−5 = 5194 L·mol−1·cm−1
ε dipende dalla molecola e dalla lunghezza d’onda: per coloranti o cromofori biologici intensamente colorati può superare 105 L·mol−1·cm−1. Valori attorno a 5000 sono tipici di transizioni d–d dei complessi di coordinazione. Poiché ε non dipende dalla concentrazione, può essere riportato come costante molecolare caratteristica a quella lunghezza d’onda.
Esercizio 4 — Retta di taratura: regressione lineare e campione incognito
Cinque soluzioni standard di permanganato (KMnO4) a 525 nm con cammino ottico b = 1,00 cm presentano le assorbanze indicate. Calcola la retta di taratura (A = m·c + q) per regressione lineare, valuta R2 e determina la concentrazione di un campione con A = 0,310.
| c (mol/L) | 2,0×10−5 | 4,0×10−5 | 6,0×10−5 | 8,0×10−5 | 1,0×10−4 |
|---|---|
| A misurata | 0,120 | 0,240 | 0,362 | 0,481 | 0,601 |
| Assorbanza campione incognito | A = 0,310 |
Soluzione passo per passo
Il metodo dei minimi quadrati per una retta y = mx + q richiede le seguenti somme (n = 5 punti):
m = nΣxiyi − ΣxiΣyinΣxi2 − (Σxi)2
Sostituendo i valori numerici (si sviluppano le somme in Python) si ottiene la pendenza:
m = 6015 L·mol−1
e l’intercetta:
q = -1×10-4
Il coefficiente di determinazione R2 misura la bontà della regressione; per una legge di Beer lineare ci si aspetta R2 > 0,999:
R2 = 1
La concentrazione incognita si ricava invertendo la retta (A = m·c + q ⇒ c = (A − q)/m):
c = 0,310 − (-1×10-4)6015 = 5.155×10-5 mol/L
Esercizio 5 — Diluizione + legge di Beer: concentrazione dell'originale
Un campione d’acqua di falda deve essere analizzato per la presenza di permanganato. La soluzione originale è troppo concentrata per rientrare nell’intervallo lineare: si preleva 1,00 mL e lo si porta a 5,00 mL con acqua (fattore di diluizione Fd = 5). La soluzione diluita ha A = 0,241 a 525 nm con b = 1,00 cm. Determina la concentrazione originale usando la retta di taratura dell’esercizio 4.
| Fattore di diluizione Fd | 5,00 |
|---|---|
| Assorbanza soluzione diluita | A = 0,241 |
| Retta di taratura | A = 6015 · c + (-1×10-4) |
| Cammino ottico b | 1,00 cm |
Soluzione passo per passo
La diluizione abbassa la concentrazione di un fattore Fd prima della misura spettrofotometrica. Dalla retta di taratura si ricava la concentrazione nella cuvetta (cdil); moltiplicando per Fd si ottiene quella originale.
corig = cdil × Fd = A − qm × Fd
Concentrazione nella cuvetta:
cdil = 0,241 − (-1×10-4)6015 = 4.008×10-5 mol/L
Concentrazione originale:
corig = 4.008×10-5 × 5,00 = 2.004×10-4 mol/L
Un errore frequente è dimenticare di correggere per la diluizione, sottostimando la concentrazione di un fattore esatto pari a Fd. In laboratorio il fattore di diluizione viene calcolato come Vfinale / Valiquota.
Esercizio 6 — Analisi di una miscela a due componenti (sistema 2 equazioni)
Una soluzione contiene cromato (CrO42−, specie X) e dicromato (Cr2O72−, specie Y) in miscela. I coefficienti di estinzione molare noti sono: εX,372 = 4800, εY,372 = 1630, εX,440 = 1050, εY,440 = 2620 (tutti in L·mol−1·cm−1, b = 1 cm). Le assorbanze della miscela sono A372 = 0,538 e A440 = 0,315. Determina le concentrazioni cX e cY.
| εX a 372 nm | 4800 L·mol−1·cm−1 |
|---|---|
| εY a 372 nm | 1630 L·mol−1·cm−1 |
| εX a 440 nm | 1050 L·mol−1·cm−1 |
| εY a 440 nm | 2620 L·mol−1·cm−1 |
| A misurata a 372 nm | 0,538 |
| A misurata a 440 nm | 0,315 |
Soluzione passo per passo
Per una miscela di due specie non interagenti la legge di Beer è additiva a ciascuna lunghezza d’onda. Si ottiene un sistema di due equazioni in due incognite:
A372 = εX,372·cX + εY,372·cY
A440 = εX,440·cX + εY,440·cY
La soluzione è ottenuta con la regola di Cramer. Il determinante della matrice dei coefficienti vale:
D = εX,372·εY,440 − εY,372·εX,440 = 4800×2620 − 1630×1050 = 1.086×107
cX = A372·εY,440 − εY,372·A440D = 8.248×10-5 mol/L
cY = εX,372·A440 − A372·εX,440D = 8.717×10-5 mol/L
Verifica: si ricalcolano le assorbanze attese e si confrontano con quelle misurate.
A372, calc = 0.538 A440, calc = 0.315
I valori ricalcolati coincidono con quelli misurati, confermando la correttezza della soluzione. Il metodo a due lunghezze d’onda è il fondamento dell’analisi multivariata spettrofotometrica ed è usato, per esempio, nel dosaggio simultaneo dell’ossiemoglobina e della deossiemoglobina nella ossimetria.
Domande frequenti
A cosa serve la retta di taratura nella spettrofotometria?
La retta di taratura collega assorbanza e concentrazione per una serie di soluzioni standard
a composizione nota. Una volta costruita, basta misurare l’assorbanza di un campione incognito
e leggere la concentrazione corrispondente sull’asse x. In questo modo si evita di dipendere dal
valore di ε (spesso affetto da incertezza strumentale) e si incorporano automaticamente le
condizioni reali di misura (matrice, temperatura, lunghezza d’onda esatta).
Quando la legge di Lambert-Beer smette di essere lineare?
La deviazione dalla linearità si manifesta tipicamente ad alta concentrazione (A > 1).
Le cause principali sono interazioni molecolari tra le specie assorbenti (formazione di aggregati,
cambiamenti di equilibrio), variazioni dell’indice di rifrazione e la non-monocromaticità
della sorgente. In pratica conviene mantenere A tra 0,1 e 0,9 per avere la massima accuratezza.
Qual è l’unità di misura del coefficiente di estinzione molare?
Con la concentrazione in mol·L−1 e il cammino ottico in cm,
ε ha unità L·mol−1·cm−1. In unità
SI (c in mol·m−3, b in m) l’unità diventa m2·mol−1.
Il fattore di conversione è 1 L·mol−1·cm−1 =
0,1 m2·mol−1.
Come si sceglie la lunghezza d’onda ottimale per la misura?
Si sceglie la lunghezza d’onda corrispondente al massimo di assorbimento (λmax)
della specie da determinare. In quel punto ε è massimo, la sensibilità è
massima e la curva di assorbimento è relativamente piatta, quindi piccole derive strumentali
sulla lunghezza d’onda hanno un effetto minimo sull’assorbanza misurata.
Cosa si fa se il campione assorbe fuori dall’intervallo lineare?
Si diluisce il campione di un fattore noto (ad esempio 1:5 o 1:10) fino a portare l’assorbanza
nell’intervallo lineare (tipicamente 0,1–0,9), si esegue la misura e si moltiplica la
concentrazione trovata per il fattore di diluizione, come mostrato nell’esercizio 5.
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Avvertenza. Questo articolo ha finalità informative e divulgative e riflette la normativa vigente alla data di pubblicazione; le scadenze indicate possono essere modificate da provvedimenti successivi. Non sostituisce la verifica tecnica del singolo prodotto e del caso specifico. A cura della Redazione di ChimicaConforme.