Spettrofluorimetria: l’analisi per fluorescenza

Alcune sostanze, colpite dalla luce, la riemettono di un colore diverso: è la fluorescenza, lo stesso fenomeno che fa brillare certi minerali sotto la lampada di Wood o che rende leggibili le banconote in controluce. In chimica analitica questo fenomeno diventa una tecnica di misura sensibilissima: la spettrofluorimetria, capace di rilevare quantità minuscole di sostanza.

Vediamo come funziona la fluorescenza usata a scopo analitico, che cosa sono gli spettri di eccitazione e di emissione e perché questa tecnica è tanto sensibile.

Dalla fluorescenza alla misura

La fluorescenza è l’emissione di luce da parte di una molecola che ha appena assorbito luce di lunghezza d’onda più corta. La molecola assorbe un fotone, sale a uno stato eccitato e poi, tornando allo stato di partenza, riemette un fotone di energia minore. La spettrofluorimetria misura proprio questa luce emessa: poiché l’intensità della fluorescenza è proporzionale alla quantità di sostanza presente, diventa un modo per misurarne la concentrazione.

Due spettri invece di uno

A differenza dell’assorbimento, la fluorescenza si descrive con due spettri distinti. Lo spettro di eccitazione mostra quali lunghezze d’onda la molecola assorbe meglio per essere “accesa”; lo spettro di emissione mostra invece a quali lunghezze d’onda essa riemette la luce. Misurando entrambi si ottiene un’impronta caratteristica della sostanza, utile sia per identificarla sia per misurarla.

Lo spostamento di Stokes

Una caratteristica fondamentale è che la luce emessa ha sempre energia minore (lunghezza d’onda maggiore) di quella assorbita. Questo scarto fra la lunghezza d’onda di assorbimento e quella di emissione si chiama spostamento di Stokes. È prezioso dal punto di vista pratico: poiché la luce emessa è di colore diverso da quella usata per eccitare, si può separarla facilmente con un filtro e misurarla senza che la luce di eccitazione, molto più intensa, la disturbi.

intensità di fluorescenza  ∝  concentrazione   (a basse concentrazioni)

Perché è così sensibile

La grande forza della spettrofluorimetria è la sensibilità, spesso molto superiore a quella della normale spettroscopia di assorbimento. Il motivo è che si misura una luce emessa su uno sfondo scuro: in assenza di sostanza fluorescente non c’è segnale, quindi anche un piccolo segnale risalta nettamente. Nella spettroscopia di assorbimento, invece, si misura una piccola diminuzione di una luce intensa, un compito più difficile. Per questo la fluorescenza permette di rilevare concentrazioni anche mille volte più basse.

Quali sostanze sono fluorescenti

Non tutte le molecole emettono fluorescenza. Tendono a essere fluorescenti le molecole rigide e con estesi sistemi di doppi legami coniugati, come molti composti aromatici. La rigidità è importante perché impedisce alla molecola di disperdere l’energia assorbita sotto forma di vibrazioni anziché di luce. Le molecole che non sono naturalmente fluorescenti si possono spesso rendere tali legandole a un’altra molecola fluorescente, una marcatura molto usata in biochimica e in diagnostica.

Le applicazioni

La spettrofluorimetria è diffusissima dove serve misurare quantità piccolissime: nel dosaggio di vitamine e farmaci, nell’analisi ambientale di inquinanti, nella biochimica con le marcature fluorescenti di proteine e acidi nucleici, e in diagnostica. È alla base di tecniche potentissime come i saggi immunologici fluorescenti e la lettura del DNA. La sua sensibilità e selettività la rendono uno strumento insostituibile in moltissimi laboratori. Vale la pena ricordare che la fluorescenza dipende anche dall’ambiente in cui si trova la molecola: la temperatura, il tipo di solvente e la presenza di certe sostanze possono aumentarla o spegnerla. Questa sensibilità all’ambiente, lungi dall’essere solo un problema, viene spesso sfruttata: molte sonde fluorescenti sono progettate proprio per cambiare emissione quando incontrano una particolare molecola o condizione, diventando rivelatori specifici di ciò che le circonda.

Eccitazione ed emissione: due monocromatori

Dal punto di vista strumentale, uno spettrofluorimetro si distingue da un normale spettrofotometro per un dettaglio importante: ha due selettori di lunghezza d’onda invece di uno. Il primo serve a scegliere la luce con cui eccitare il campione, il secondo a selezionare la lunghezza d’onda a cui osservare l’emissione. Inoltre, il rivelatore non è posto in linea con la luce di eccitazione, ma di lato, di solito ad angolo retto: questa geometria è studiata per non far arrivare al rivelatore la luce di eccitazione, ma solo quella emessa dal campione in tutte le direzioni. È proprio questa separazione fisica fra il cammino della luce di eccitazione e quello dell’osservazione a permettere di misurare la debole fluorescenza senza essere accecati dalla sorgente. La possibilità di regolare indipendentemente le due lunghezze d’onda rende inoltre lo strumento molto flessibile: si può ottimizzare l’eccitazione per una sostanza e osservarne l’emissione caratteristica, ottenendo la massima selettività anche in presenza di altre sostanze.

Domande frequenti

Che cos’è la spettrofluorimetria?

È una tecnica analitica che misura la luce emessa per fluorescenza da una sostanza dopo che ha assorbito luce. L’intensità dell’emissione è proporzionale alla concentrazione, rendendola un metodo molto sensibile per l’analisi quantitativa di piccole quantità di sostanza.

Che differenza c’è fra spettro di eccitazione e di emissione?

Lo spettro di eccitazione mostra quali lunghezze d’onda la molecola assorbe meglio per essere eccitata; lo spettro di emissione mostra a quali lunghezze d’onda riemette la luce. Insieme forniscono un’impronta caratteristica della sostanza, utile per identificarla e misurarla.

Che cos’è lo spostamento di Stokes?

È lo scarto fra la lunghezza d’onda della luce assorbita e quella della luce emessa: l’emissione avviene sempre a energia minore, cioè a lunghezza d’onda maggiore. Questo scarto permette di separare facilmente con un filtro la debole luce emessa da quella intensa usata per eccitare.

Perché la fluorescenza è più sensibile dell’assorbimento?

Perché misura un segnale su uno sfondo scuro: senza sostanza fluorescente non c’è luce, quindi anche un piccolo segnale risalta. Nell’assorbimento, invece, si misura una piccola diminuzione di una luce intensa, compito più difficile. Per questo la fluorescenza rileva concentrazioni molto più basse.

Quali sostanze danno fluorescenza?

Soprattutto le molecole rigide con estesi sistemi di doppi legami coniugati, come molti composti aromatici. Le molecole non fluorescenti si possono spesso marcare legandole a una molecola fluorescente, tecnica molto usata in biochimica e diagnostica per rendere rilevabili sostanze altrimenti invisibili.