NMR bidimensionale: COSY, HSQC e cross-peak

Per molecole semplici, lo spettro NMR normale basta a ricostruire la struttura. Ma per molecole complesse — proteine, prodotti naturali, farmaci — i segnali si affollano e si sovrappongono, e diventa impossibile capire quale atomo è vicino a quale. La soluzione è distribuire l’informazione su due dimensioni: è la NMR bidimensionale, una delle tecniche più potenti per determinare le strutture molecolari.

Vediamo perché serve una seconda dimensione, come si legge una mappa NMR bidimensionale e che cosa rivelano i suoi caratteristici “cross-peak”.

Il problema dell’affollamento

Uno spettro NMR normale è unidimensionale: i segnali sono distribuiti lungo un solo asse, quello dello spostamento chimico. Per una molecola con molti atomi, i segnali si accalcano e si sovrappongono, rendendo impossibile distinguerli e capire come gli atomi siano collegati fra loro. Serviva un modo per “sparpagliare” i segnali e, soprattutto, per mostrare le relazioni fra di essi.

L’idea: una seconda dimensione

La NMR bidimensionale risolve il problema distribuendo i segnali su un piano, con due assi invece di uno. Il risultato non è più un grafico con dei picchi, ma una mappa, in cui i segnali appaiono come macchie a precise coordinate. Questo non solo riduce l’affollamento, ma soprattutto permette di mostrare quali nuclei sono in relazione fra loro, un’informazione che lo spettro unidimensionale non può dare.

Come si legge la mappa

Su una mappa NMR bidimensionale i due assi riportano entrambi lo spostamento chimico. Lungo la diagonale si ritrova lo spettro normale, con ogni segnale che corrisponde a sé stesso. La vera ricchezza sta però fuori dalla diagonale, dove compaiono macchie aggiuntive chiamate cross-peak. Ogni cross-peak collega due segnali sui due assi, e indica che i due nuclei corrispondenti sono in qualche modo connessi.

cross-peak a (δ_A, δ_B)  →  il nucleo A e il nucleo B sono accoppiati

I cross-peak: chi è vicino a chi

I cross-peak sono il cuore della tecnica. Nella versione più comune, ciascun cross-peak indica che due nuclei sono accoppiati, cioè abbastanza vicini nella molecola da influenzarsi a vicenda. Partendo da un segnale e seguendo i cross-peak, si può “camminare” lungo la molecola da un atomo all’altro, ricostruendone la connettività come si seguono le stanze di una casa attraverso le porte. È così che si determina la struttura anche di molecole molto complesse.

Le diverse tecniche bidimensionali

Esistono molte varianti della NMR bidimensionale, ciascuna che rivela un tipo diverso di relazione fra i nuclei. Alcune mostrano gli accoppiamenti fra nuclei dello stesso tipo, per esempio fra atomi di idrogeno vicini; altre collegano nuclei di tipo diverso, per esempio ciascun idrogeno al carbonio a cui è legato; altre ancora rivelano quali nuclei sono vicini nello spazio, anche se non direttamente legati. Combinando più tecniche si ottiene un quadro completo della struttura.

Perché è così importante

La NMR bidimensionale ha trasformato la determinazione delle strutture molecolari: ciò che con la NMR normale richiederebbe ipotesi e congetture, con quella bidimensionale diventa una lettura quasi diretta delle connessioni fra gli atomi. È indispensabile nella chimica dei prodotti naturali, nella ricerca farmaceutica e nella biologia strutturale. Rappresenta uno degli esempi più belli di come aggiungere una dimensione a una misura possa moltiplicarne enormemente il potere informativo.

Come nasce la seconda dimensione

Ci si può chiedere da dove venga, concretamente, la seconda dimensione. La risposta sta nel modo in cui l’esperimento è condotto: invece di registrare un unico segnale, se ne registrano molti, variando in modo sistematico un intervallo di tempo all’interno della sequenza di impulsi che genera il segnale. Ciascun segnale viene raccolto con un valore diverso di quell’intervallo, e l’insieme di tutti questi segnali, opportunamente elaborato, dà origine alla seconda dimensione. In altre parole, la prima dimensione viene dal segnale così come lo si misura, la seconda dall’aver ripetuto la misura tante volte cambiando un tempo interno. È un’idea ingegnosa: aggiungere informazione non misurando una grandezza diversa, ma ripetendo la stessa misura in condizioni che cambiano in modo controllato. L’elaborazione matematica che trasforma questa serie di segnali in una mappa leggibile è la stessa famiglia di calcoli che sta dietro a moltissime tecniche strumentali moderne, e si esegue oggi in modo automatico.

Domande frequenti

Che cos’è la NMR bidimensionale?

È una famiglia di tecniche NMR in cui i segnali sono distribuiti su due assi anziché uno, formando una mappa invece di un grafico a picchi. Serve a ridurre l’affollamento dei segnali e, soprattutto, a evidenziare le relazioni fra i nuclei, fondamentale per le molecole complesse.

Perché serve una seconda dimensione?

Perché negli spettri normali di molecole complesse i segnali si accalcano e si sovrappongono, rendendo impossibile distinguerli e capire come gli atomi siano collegati. Distribuendoli su due assi si separano meglio e si possono mostrare le relazioni fra di essi, impossibili da vedere in una sola dimensione.

Che cosa sono i cross-peak?

Sono le macchie che compaiono fuori dalla diagonale della mappa. Ogni cross-peak collega due segnali sui due assi e indica che i nuclei corrispondenti sono in relazione, di solito perché accoppiati e quindi vicini nella molecola. Seguendoli si ricostruisce la connettività della struttura.

Che cosa si trova sulla diagonale?

Sulla diagonale della mappa si ritrova lo spettro NMR normale: ogni segnale corrisponde a sé stesso. L’informazione nuova e utile sta invece fuori dalla diagonale, nei cross-peak, che rivelano le relazioni fra nuclei diversi.

A cosa serve in pratica?

Serve a determinare la struttura di molecole complesse come prodotti naturali, farmaci e proteine. Permette di stabilire quali atomi sono legati o vicini fra loro, quasi leggendo direttamente la connettività della molecola. È indispensabile nella ricerca farmaceutica, nella chimica dei prodotti naturali e nella biologia strutturale.