Selettività e fattore di separazione α in cromatografia

Due picchi possono restare attaccati anche con una colonna efficientissima, se la separazione «non distingue» abbastanza le due sostanze. Questa capacità di distinguere si chiama selettività e si misura con il fattore di separazione α. È, tra i parametri di una separazione, quello su cui conviene agire per primo: un piccolo aumento di α può risolvere ciò che nessuna colonna più lunga riuscirebbe a separare.

Vediamo come si definisce α, qual è la differenza tra selettività ed efficienza, perché α è la leva più potente sulla risoluzione e come si fa, in pratica, ad aumentarlo.

La definizione di α

Il fattore di separazione confronta la ritenzione di due analiti adiacenti. È semplicemente il rapporto tra i loro fattori di ritenzione, calcolato sempre col più trattenuto al numeratore, così che α sia maggiore o uguale a 1.

α = k₂k₁  (con k₂ ≥ k₁, quindi α ≥ 1)

Se α = 1, i due analiti hanno lo stesso fattore di ritenzione: coeluiscono e non possono essere separati, per quanto efficiente sia la colonna. Se α > 1, i due picchi tendono a separarsi; più α è grande, più la separazione è facile. Tipicamente α vale poco più di 1 (per esempio 1,05–1,20) per le coppie critiche, e proprio in questo intervallo piccoli cambiamenti hanno effetti grandi.

Selettività e efficienza: due cose diverse

È fondamentale non confondere selettività ed efficienza, perché agiscono su aspetti diversi del cromatogramma. L’efficienza (N) governa quanto sono stretti i picchi; la selettività (α) governa quanto sono distanti. Una colonna molto efficiente dà picchi sottili, ma se α è vicino a 1 quei picchi sottili restano comunque addossati l’uno all’altro. Viceversa, una buona selettività allontana i massimi, e basta allora un’efficienza modesta per separarli.

Perché α è la leva più potente

Nell’equazione fondamentale della risoluzione, il termine legato alla selettività è (α − 1)/α. La sua particolarità è che, quando α è vicino a 1, anche una piccola variazione produce un grande cambiamento di risoluzione.

R_s = √N4 · α − 1α · k1 + k

Per dare un’idea: passare da α = 1,05 a α = 1,10 quasi raddoppia il termine di selettività, e quindi la risoluzione, senza toccare la colonna né i tempi. Ottenere lo stesso guadagno agendo solo sull’efficienza richiederebbe di quadruplicare N. Ecco perché, di fronte a due picchi mal separati, la mossa più intelligente è quasi sempre lavorare sulla selettività anziché allungare la colonna o rallentare il flusso.

Il ruolo del pH per gli analiti ionizzabili

Per acidi e basi deboli, il pH della fase mobile è una delle leve più efficaci sulla selettività. La forma in cui si trova un analita — neutra o ionizzata — ne cambia radicalmente la ritenzione: la forma neutra è in genere molto più trattenuta in fase inversa rispetto alla forma carica. Due analiti con costanti di dissociazione diverse rispondono al pH in modo diverso, perciò spostare il pH della fase mobile attorno ai loro valori di pK_a modifica i rispettivi k in misura diversa e quindi cambia α. È spesso il primo aggiustamento da provare quando si separano molecole acide o basiche, perché può ribaltare l’ordine di eluizione e risolvere coppie altrimenti coeluenti.

I punti chiave sulla selettività

Riassumendo, vale la pena fissare i concetti operativi che guidano l’ottimizzazione di una separazione.

Perché conta nella pratica

La selettività è la leva regina dell’ottimizzazione cromatografica. Quando due picchi non si separano, capire se il problema è di selettività (picchi vicini) o di efficienza (picchi larghi) indirizza verso la soluzione giusta ed evita interventi inutili. Poiché α agisce sulla risoluzione in modo molto più potente di N, imparare a manovrare pH, fase mobile, fase stazionaria e temperatura per spostare α è la competenza che più di ogni altra rende un tecnico capace di mettere a punto metodi robusti e rapidi.

Domande frequenti

Che cos’è il fattore di separazione α?

È il rapporto tra i fattori di ritenzione di due analiti adiacenti, α = k₂/k₁, con il più trattenuto al numeratore così che α sia sempre maggiore o uguale a 1. Misura la selettività della separazione, cioè quanto il sistema trattiene in modo diverso le due sostanze. Se α = 1 i picchi coeluiscono; valori superiori a 1 rendono possibile separarli.

Qual è la differenza tra selettività ed efficienza?

La selettività (α) governa quanto sono distanti i picchi, l’efficienza (N) quanto sono stretti. Una colonna efficiente produce picchi sottili, ma se α è vicino a 1 restano comunque addossati; una buona selettività allontana i massimi e permette di separarli anche con efficienza modesta. Sono due aspetti distinti, da non confondere quando si diagnostica una separazione insufficiente.

Perché α è la leva più potente sulla risoluzione?

Perché nell’equazione fondamentale il termine di selettività è (α − 1)/α, che quando α è vicino a 1 cambia molto anche per piccole variazioni. Passare da α = 1,05 a α = 1,10 quasi raddoppia la risoluzione; ottenere lo stesso guadagno con l’efficienza richiederebbe di quadruplicare il numero di piatti. Per questo conviene agire prima sulla selettività.

Come si aumenta la selettività?

Cambiando la chimica della separazione: tipo o percentuale del solvente organico nella fase mobile, pH (cruciale per gli analiti ionizzabili), chimica della fase stazionaria (per esempio da C18 a fenile o a uno scambiatore ionico), aggiunta di modificatori o agenti di coppia ionica, temperatura. Anche piccoli aggiustamenti di questi parametri possono spostare α quanto basta a separare una coppia critica.

Che cosa succede se α è uguale a 1?

I due analiti hanno lo stesso fattore di ritenzione e coeluiscono: escono nello stesso punto del cromatogramma e non possono essere separati, per quanto efficiente sia la colonna. È la situazione di selettività nulla. L’unico modo per separarli è modificare la chimica del sistema in modo da rendere α maggiore di 1, allontanando i due picchi.