Cromatografia a esclusione dimensionale (SEC/GPC)

Come si separano le molecole non in base alla loro natura chimica, ma semplicemente alla loro dimensione? E come si misura quanto è lungo, in media, un polimero? La risposta a entrambe le domande è una tecnica elegante e un po’ controintuitiva: la cromatografia a esclusione dimensionale, in cui, sorprendentemente, escono prima le molecole più grandi.

Vediamo come funziona questa separazione per dimensione, perché le molecole grandi escono per prime e a cosa serve soprattutto questa tecnica.

Una separazione per dimensione

La cromatografia a esclusione dimensionale separa le molecole in base alla loro grandezza, e non alla loro affinità chimica per la colonna. La colonna è riempita di granuli porosi, attraversati da una rete di minuscoli canali e cavità. Mentre il liquido trasporta le molecole attraverso questi granuli, le molecole interagiscono con i pori in modo diverso a seconda delle loro dimensioni: ed è questa diversa interazione a separarle.

Perché le grandi escono per prime

Qui sta l’aspetto controintuitivo. Le molecole grandi sono troppo voluminose per entrare nei pori dei granuli: restano nel flusso principale e attraversano la colonna per la via più diretta, uscendo per prime. Le molecole piccole, invece, riescono a infilarsi nei pori, dove si attardano percorrendo un cammino molto più lungo e tortuoso: di conseguenza escono dopo. È esattamente il contrario di quanto si potrebbe immaginare e di quanto accade nelle altre cromatografie.

dimensione grande → esclusa dai pori → esce prima   |   dimensione piccola → entra nei pori → esce dopo

Niente affinità chimica: solo geometria

Una caratteristica importante è che, idealmente, in questa tecnica le molecole non si legano al materiale della colonna: non c’è affinità chimica in gioco, solo la geometria dei pori. Questo la rende una separazione “gentile”, che non altera le molecole e non rischia di trattenerle. È un vantaggio prezioso quando si lavora con molecole delicate come le proteine, che si vogliono separare senza danneggiarle.

L’applicazione principale: misurare i polimeri

L’uso più importante della cromatografia a esclusione dimensionale è la caratterizzazione dei polimeri. Un polimero non è fatto di molecole tutte uguali, ma di catene di lunghezze diverse; questa tecnica permette di misurare la distribuzione delle dimensioni delle catene, cioè quanto sono lunghe in media e quanto variano. È un’informazione fondamentale, perché la lunghezza delle catene determina molte proprietà di un materiale plastico, come la resistenza e la viscosità.

Anche per le biomolecole

Oltre ai polimeri sintetici, la tecnica è molto usata in biochimica per separare e caratterizzare proteine e altre biomolecole in base alla loro dimensione. Permette per esempio di separare le proteine grandi da quelle piccole, di stimare la massa di una proteina sconosciuta o di purificare una biomolecola da contaminanti di dimensione diversa. La sua delicatezza la rende ideale per questi campioni fragili. In molti laboratori biochimici è una tappa abituale nella purificazione delle proteine, dove serve a separare la proteina di interesse da frammenti più piccoli o da aggregati più grandi, sfruttando semplicemente la differenza di dimensione.

La curva di taratura con molecole di riferimento

Per trasformare i tempi di uscita in dimensioni o masse effettive, la cromatografia a esclusione dimensionale ha bisogno di una taratura particolare. Si fanno passare attraverso la colonna alcune molecole di riferimento di dimensione nota, e si registra a che tempo escono. Si costruisce così una curva che lega il tempo di uscita alla dimensione: le molecole grandi a tempi brevi, le piccole a tempi lunghi. Confrontando il tempo di uscita di una molecola sconosciuta con questa curva, si stima la sua dimensione o la sua massa. È importante che le molecole di riferimento siano simili per natura a quelle da analizzare, perché la separazione dipende dalla dimensione effettiva che la molecola assume in soluzione, e questa può variare a seconda del tipo di molecola e del liquido usato. Per questo, quando si caratterizza un polimero, si usano di solito riferimenti dello stesso tipo o si applicano correzioni che tengono conto delle differenze. Senza una taratura adeguata, i tempi di uscita resterebbero numeri privi di significato pratico; con essa, diventano misure quantitative della dimensione e della massa delle molecole.

Domande frequenti

Che cos’è la cromatografia a esclusione dimensionale?

È una tecnica cromatografica che separa le molecole in base alla loro dimensione anziché alla natura chimica, usando granuli porosi. Le molecole grandi, escluse dai pori, escono prima delle piccole. È molto usata per caratterizzare polimeri e proteine.

Perché le molecole grandi escono per prime?

Perché sono troppo voluminose per entrare nei pori dei granuli: restano nel flusso principale e percorrono il cammino più breve, uscendo per prime. Le molecole piccole entrano nei pori, percorrono un cammino più lungo e tortuoso, e quindi escono dopo. È il contrario delle altre cromatografie.

Le molecole si legano alla colonna?

Idealmente no: in questa tecnica non c’è affinità chimica fra le molecole e il materiale della colonna, solo la geometria dei pori. Questo la rende una separazione gentile, che non altera le molecole, vantaggiosa soprattutto con campioni delicati come le proteine.

A cosa serve principalmente?

Serve soprattutto a caratterizzare i polimeri, misurando la distribuzione delle lunghezze delle loro catene, informazione che determina molte proprietà del materiale. È molto usata anche in biochimica per separare e caratterizzare proteine e altre biomolecole in base alla dimensione.

Perché si chiama anche a permeazione di gel?

Perché, soprattutto nel campo dei polimeri sintetici, il materiale poroso che riempie la colonna è chiamato gel. I due nomi indicano la stessa tecnica e lo stesso principio di separazione per dimensione: la parola gel si riferisce semplicemente al materiale della colonna.