Le colonne HPLC: C18 e dimensione delle particelle

La colonna è il cuore dell’HPLC: è lì che avviene la separazione. Tra i molti parametri che la definiscono, due contano più di tutti per la qualità del risultato: la chimica della fase stazionaria — quasi sempre C18 in fase inversa — e la dimensione delle particelle che la compongono. È quest’ultima, oggi, a segnare il confine fra HPLC tradizionale e UHPLC.

Vediamo com’è fatta una colonna C18, perché la dimensione delle particelle determina l’efficienza, che cos’è l’UHPLC e come incidono lunghezza e diametro della colonna.

La colonna C18

La fase stazionaria più diffusa in fase inversa è la C18: microsfere di silice porosa alla cui superficie sono legate catene alchiliche a 18 atomi di carbonio (octadecil, da cui il nome ODS). Queste catene apolari formano lo «strato» che trattiene gli analiti apolari. Esistono varianti più corte (C8, C4) per molecole molto idrofobiche o per le proteine, e fasi diverse (fenil, ciano, ammino) per selettività particolari, ma la C18 resta la fase di prima scelta, robusta e ben caratterizzata.

La dimensione delle particelle

La silice è impaccata sotto forma di microsfere il cui diametro è il parametro più influente sull’efficienza. Le particelle classiche misurano 5 micrometri; quelle a 3 micrometri offrono picchi più stretti; quelle sub-2 micrometri (sotto i 2 micrometri) portano l’efficienza al massimo. Il motivo è che con particelle più piccole il percorso degli analiti è più uniforme e gli scambi fra le fasi più rapidi: i picchi si allargano di meno e la risoluzione migliora. Più piccola è la particella, più efficiente è la colonna.

particella più piccola  →  picchi più stretti (più efficienza)  ma→  contropressione più alta

C’è però un prezzo da pagare. Far passare la fase mobile attraverso un letto di particelle molto piccole richiede una pressione molto più alta: la contropressione cresce rapidamente al diminuire del diametro delle particelle. Un sistema HPLC tradizionale, progettato per ~400 bar, non regge le particelle sub-2 micrometri.

L’UHPLC

Per sfruttare le particelle sub-2 micrometri sono nati gli strumenti UHPLC (cromatografia liquida ad altissime prestazioni), capaci di operare a 1000 bar e oltre. Rispetto all’HPLC tradizionale, l’UHPLC offre separazioni più efficienti e soprattutto molto più rapide: analisi che richiedevano venti minuti si chiudono in pochi minuti, con minor consumo di solvente. È diventata uno standard nei laboratori ad alto volume di campioni, dove la velocità di throughput è decisiva.

Lunghezza e diametro della colonna

Oltre alle particelle, contano le dimensioni geometriche della colonna. Una colonna più lunga offre più «piatti teorici» e quindi maggiore risoluzione, ma allunga i tempi e aumenta la contropressione. Il diametro interno incide sul volume e sulla portata: colonne strette (microbore) consumano meno solvente e si abbinano bene alla rivelazione MS, mentre quelle più larghe sopportano carichi maggiori. La scelta è un compromesso fra risoluzione, velocità, pressione e consumo di solvente.

Va ricordato che la risoluzione cresce solo con la radice quadrata della lunghezza: raddoppiare la colonna non raddoppia la separazione ma la migliora di circa il quaranta per cento, raddoppiando però tempi e pressione. Per questo, di fronte a due picchi che non si separano, è quasi sempre più efficiente ridurre la dimensione delle particelle o cambiare la selettività (fase mobile, fase stazionaria) piuttosto che allungare la colonna. La geometria si sceglie in armonia con le particelle e con il rivelatore a valle.

Perché conta nella pratica

Scegliere la colonna giusta è metà del lavoro di un metodo HPLC. Per un tecnico di azienda chimica, capire che la C18 è il punto di partenza, che le particelle più piccole danno più risoluzione ma esigono pressioni e strumenti adeguati, e che lunghezza e diametro sono compromessi, significa saper bilanciare risoluzione, velocità e robustezza. Sapere quando vale la pena passare all’UHPLC o alle particelle core-shell, e quando una colonna 5 micrometri tradizionale è più che sufficiente, evita acquisti sbagliati e metodi fragili, e rende prevedibile la qualità del cromatogramma.

Domande frequenti

Che cos’è una colonna C18?

È una colonna HPLC a fase inversa la cui fase stazionaria è costituita da microsfere di silice porosa con catene alchiliche a 18 atomi di carbonio legate alla superficie. Queste catene apolari trattengono gli analiti apolari. È la fase di prima scelta in fase inversa perché robusta, ben caratterizzata e adatta alla maggior parte delle molecole organiche.

Perché la dimensione delle particelle è così importante?

Perché determina l’efficienza della colonna. Particelle più piccole rendono più uniforme il percorso degli analiti e più rapidi gli scambi fra le fasi: i picchi si allargano meno e la risoluzione migliora. Passando da 5 a 3 e poi a sotto i 2 micrometri si ottengono picchi sempre più stretti, al prezzo di una contropressione che cresce rapidamente.

Che cos’è l’UHPLC?

È la cromatografia liquida ad altissime prestazioni: usa colonne con particelle sotto i 2 micrometri e strumenti capaci di operare a 1000 bar e oltre. Offre separazioni più efficienti e soprattutto molto più rapide rispetto all’HPLC tradizionale, con minor consumo di solvente. È lo standard nei laboratori ad alto volume di campioni dove conta la velocità di analisi.

Le particelle più piccole vanno bene su qualsiasi strumento?

No. Le particelle sotto i 2 micrometri generano contropressioni che un sistema HPLC tradizionale, progettato per circa 400 bar, non sopporta: servono strumenti UHPLC. Una soluzione intermedia sono le particelle core-shell, che offrono un’efficienza vicina con pressioni più contenute e funzionano anche su molti strumenti HPLC classici.

Come scelgo lunghezza e diametro della colonna?

In base al compromesso fra risoluzione, velocità, pressione e consumo di solvente. Una colonna più lunga dà più risoluzione ma allunga i tempi e aumenta la pressione; un diametro interno più piccolo riduce il consumo di solvente e si accoppia meglio alla rivelazione MS, mentre uno più largo regge carichi maggiori. Si sceglie secondo l’obiettivo dell’analisi.