Fase inversa e fase normale: come funziona l’HPLC

In HPLC quasi tutto si gioca sulla coppia colonna-fase mobile, e la prima scelta è la più decisiva: fase inversa o fase normale. È una decisione che dipende dalla polarità degli analiti e che, nove volte su dieci nei laboratori di azienda chimica, ricade sulla fase inversa. Capire perché è il punto di partenza per impostare un metodo che funzioni.

Vediamo come si separano gli analiti in cromatografia liquida, che cosa distingue la fase inversa dalla fase normale, come scegliere l’una o l’altra e perché la fase inversa domina la pratica quotidiana.

La ripartizione fra due fasi

In HPLC la separazione nasce dalla diversa affinità di ogni analita per due fasi: la fase stazionaria, impaccata dentro la colonna, e la fase mobile liquida che la attraversa sotto pressione. Una molecola che «preferisce» la fase stazionaria viene trattenuta a lungo ed esce tardi; una che preferisce la fase mobile attraversa la colonna in fretta. Questa differenza di trattenimento, ripetuta su milioni di equilibri lungo la colonna, separa i componenti di una miscela in picchi distinti.

Fase normale e fase inversa

Le due grandi famiglie di HPLC si distinguono per la polarità relativa delle due fasi. Nella fase normale (NP) la fase stazionaria è polare (silice nuda, gruppi silanolici, oppure fasi amminiche o ciano) e la fase mobile è apolare (esano, con piccole aggiunte di solventi più polari). Trattiene di più gli analiti polari. Nella fase inversa (RP, da reversed phase) la situazione è capovolta: la fase stazionaria è apolare (tipicamente silice modificata con catene C18) e la fase mobile è polare (acqua mescolata a metanolo o acetonitrile). Trattiene di più gli analiti apolari.

RP: stazionaria apolare (C18) + mobile polare (H₂O / MeOH / ACN)  →  trattiene gli apolari

Il nome «inversa» è storico: la fase normale, sviluppata per prima, usava la silice polare; quando si capovolse lo schema con la fase stazionaria apolare, si parlò di fase «inversa». Oggi la fase inversa è di gran lunga la più usata, al punto che spesso «HPLC» sottintende RP.

La regola della polarità

La logica del trattenimento si riassume in una regola pratica: «il simile trattiene il simile». In fase inversa una molecola apolare si trova bene fra le catene C18 e viene trattenuta a lungo; per farla eluire prima si rende la fase mobile meno polare, aumentando la percentuale di solvente organico. In fase normale è l’opposto: l’analita polare è trattenuto sulla silice, e per accelerarlo si rende la fase mobile più polare. Conoscere la polarità degli analiti consente di prevedere l’ordine di eluizione e di regolare il trattenimento.

Perché la fase inversa domina

La fase inversa si è imposta per ragioni molto concrete. La fase mobile è a base d’acqua, quindi compatibile con la maggior parte dei campioni reali (estratti acquosi, soluzioni biologiche, formulazioni) e con i tamponi che servono a controllare la ionizzazione. È robusta e riproducibile: gli equilibri sono rapidi e i tempi di ritenzione stabili. Copre la grande maggioranza delle molecole organiche di interesse, da piccoli farmaci ad additivi e impurezze. Infine i solventi sono meno costosi e meno tossici dell’esano della fase normale. Per il tecnico significa metodi facili da trasferire e mantenere nel tempo.

Perché conta nella pratica

Scegliere fra fase inversa e fase normale è la prima decisione di ogni sviluppo di metodo, e orienta tutto il resto: colonna, solventi, gradiente, rivelatore. Per un tecnico di azienda chimica, sapere che gli analiti apolari vanno trattenuti in fase inversa e regolati con la percentuale di organico, mentre la fase normale resta l’arma per gli isomeri e i composti liposolubili, significa impostare metodi che funzionano al primo colpo. Comprendere la regola della polarità evita errori grossolani come la scelta di una fase incompatibile con il campione, e rende leggibile e prevedibile ogni cromatogramma.

Domande frequenti

Qual è la differenza fra fase inversa e fase normale in HPLC?

Sta nella polarità relativa delle fasi. In fase normale la fase stazionaria è polare (silice) e la mobile apolare (esano): trattiene gli analiti polari. In fase inversa la fase stazionaria è apolare (C18) e la mobile polare (acqua con metanolo o acetonitrile): trattiene gli analiti apolari. L’ordine di eluizione è di conseguenza opposto fra le due modalità.

Perché la fase inversa è la più usata?

Perché la sua fase mobile è a base d’acqua, quindi compatibile con la maggior parte dei campioni reali e con i tamponi; perché è robusta, riproducibile e con equilibri rapidi; perché copre quasi tutte le molecole organiche comuni; e perché i suoi solventi sono più economici e meno tossici dell’esano. Per questo è la scelta di partenza nel controllo qualità di routine.

Quando conviene usare la fase normale?

Quando si devono separare isomeri molto simili, oppure analizzare molecole molto apolari come grassi e vitamine liposolubili, che in fase inversa eluirebbero tutte insieme. La fase normale offre selettività diverse e utili in questi casi, al prezzo di equilibri più lenti e di una forte sensibilità all’acqua residua nei solventi, che ne riduce la riproducibilità.

Come regolo il tempo di ritenzione in fase inversa?

Agendo sulla polarità della fase mobile. Aumentando la percentuale di solvente organico (metanolo o acetonitrile) la fase mobile diventa meno polare, gli analiti apolari sono meno trattenuti ed escono prima. Riducendola, aumenta il trattenimento e i tempi si allungano. È la leva principale per ottenere una buona separazione senza tempi eccessivi.

Perché si chiama fase «inversa»?

Per ragioni storiche. La cromatografia liquida nacque con la silice polare come fase stazionaria, cioè in fase normale. Quando si capovolse lo schema, usando una fase stazionaria apolare (le catene C18) e una mobile polare, si parlò di fase «inversa» rispetto a quella originaria. Oggi questa modalità è la più diffusa, tanto che «HPLC» spesso la sottintende.