Eluizione isocratica e in gradiente in HPLC

Una volta scelta la fase inversa, la domanda successiva è: la composizione della fase mobile resta costante per tutta la corsa, o cambia nel tempo? È la scelta fra eluizione isocratica e in gradiente, e decide se un metodo sarà semplice e robusto o capace di affrontare miscele molto complesse.

Vediamo che cos’è la forza eluotropica, come funzionano l’eluizione isocratica e quella in gradiente, quando conviene ciascuna e perché il gradiente richiede una fase di ri-equilibrio.

La forza eluotropica della fase mobile

In fase inversa, la capacità della fase mobile di «strappare» gli analiti dalla fase stazionaria — la sua forza eluotropica — cresce con la percentuale di solvente organico. Una fase mobile molto acquosa è debole: trattiene a lungo gli analiti apolari. Aggiungendo metanolo o acetonitrile la fase mobile diventa più forte, riduce il trattenimento e accorcia i tempi di ritenzione. Regolare la percentuale di organico è quindi il modo per controllare quanto rapidamente gli analiti attraversano la colonna.

forza eluotropica  →  cresce con % organico  →  tempi di ritenzione più brevi

Eluizione isocratica

Nell’eluizione isocratica la composizione della fase mobile resta costante per tutta la corsa: ad esempio 60% acetonitrile e 40% acqua dall’inizio alla fine (dal greco iso-cratos, «stessa forza»). È la modalità più semplice: bastano una pompa e un solo serbatoio (o una premiscela), la linea di base è stabile e il metodo è facile da trasferire fra strumenti. Funziona bene quando gli analiti hanno polarità simili e una sola forza eluotropica li separa tutti in un tempo ragionevole.

Eluizione in gradiente

Nell’eluizione in gradiente la composizione della fase mobile cambia durante la corsa: si parte da una fase mobile debole (molto acquosa) e si aumenta progressivamente la percentuale di organico secondo un profilo programmato. All’inizio, con fase mobile debole, gli analiti più polari si separano bene; man mano che il gradiente sale, la forza eluotropica cresce e fa eluire anche gli analiti più trattenuti, che con una fase debole resterebbero quasi fermi. È la soluzione per le miscele complesse, con componenti di polarità molto diverse.

Il problema del gradiente: il ri-equilibrio

Il gradiente ha un costo nascosto. Al termine della corsa, la colonna è stata «caricata» con una fase mobile forte, ricca di organico, mentre la corsa successiva deve ripartire dalle condizioni iniziali deboli. Occorre quindi una fase di ri-equilibrio: si riporta la fase mobile alla composizione di partenza e la si fa fluire per diversi volumi di colonna, finché la fase stazionaria torna nello stato iniziale. Senza un ri-equilibrio adeguato, i tempi di ritenzione non sono riproducibili da una corsa all’altra.

Il ri-equilibrio incide pesantemente sul tempo di ciclo totale: una buona regola pratica è far fluire dieci o più volumi di colonna di fase mobile iniziale prima di iniettare il campione successivo. Questo tempo, sommato a quello della corsa, spiega perché un metodo in gradiente è meno produttivo di uno isocratico a parità di separazione. Il gradiente, inoltre, è più sensibile alle differenze fra strumenti, perché ogni sistema ha un proprio «volume di ritardo» fra la pompa e la colonna: trasferire un metodo in gradiente da uno strumento all’altro richiede attenzione a questo dettaglio, mentre un metodo isocratico si trasferisce con maggiore facilità.

Perché conta nella pratica

La scelta fra isocratica e gradiente determina la robustezza, la durata e la trasferibilità di un metodo. Per un tecnico, sapere che l’isocratica è più semplice, stabile e validabile, mentre il gradiente è la chiave per le miscele complesse al prezzo di un ri-equilibrio attento, evita due errori opposti: forzare un’isocratica su una miscela troppo ampia (con picchi schiacciati o intrappolati) o complicare con un gradiente un’analisi che un metodo a forza costante risolverebbe meglio. Capire la forza eluotropica è la chiave per regolare entrambe le modalità e leggere i cromatogrammi con sicurezza.

Domande frequenti

Che differenza c’è fra eluizione isocratica e gradiente?

Nell’eluizione isocratica la composizione della fase mobile resta costante per tutta la corsa; nel gradiente cambia nel tempo, di norma aumentando la percentuale di solvente organico. L’isocratica è più semplice e robusta e va bene per analiti di polarità simile; il gradiente serve per separare in un’unica corsa miscele con componenti di polarità molto diverse.

Che cos’è la forza eluotropica?

È la capacità della fase mobile di strappare gli analiti dalla fase stazionaria e farli eluire. In fase inversa cresce con la percentuale di solvente organico: più metanolo o acetonitrile significa fase mobile più forte, trattenimento minore e tempi di ritenzione più brevi. Regolarla è il modo principale per controllare la velocità con cui gli analiti attraversano la colonna.

Quando conviene usare un gradiente?

Quando la miscela contiene componenti di polarità molto diverse, che una sola forza eluotropica non riuscirebbe a separare in un tempo ragionevole: alcuni uscirebbero troppo presto, altri resterebbero quasi fermi sulla colonna. Il gradiente, partendo da una fase mobile debole e salendo, fa eluire in sequenza analiti via via più trattenuti, risolvendo le miscele complesse.

Perché dopo un gradiente serve il ri-equilibrio?

Perché a fine corsa la colonna è caricata con una fase mobile forte, ricca di organico, mentre la corsa successiva deve ripartire dalle condizioni iniziali deboli. Riportando la fase mobile alla composizione di partenza e facendola fluire per diversi volumi di colonna si riporta la fase stazionaria allo stato iniziale, garantendo tempi di ritenzione riproducibili tra una corsa e l’altra.

È meglio l’isocratica o il gradiente?

Dipende dal campione. Quando possibile è preferibile l’isocratica, perché è più semplice, stabile, robusta e facile da validare e trasferire. Si passa al gradiente solo quando la miscela è troppo eterogenea per una forza eluotropica costante. La buona pratica è provare prima l’isocratica e riservare il gradiente alle separazioni che lo richiedono davvero.