HPLC quantitativa e retta di taratura

L’HPLC non serve solo a sapere quali sostanze ci sono in un campione, ma soprattutto quanto ce n’è. La quantificazione è il cuore del controllo qualità: titolo di un principio attivo, livello di un’impurezza, concentrazione di un additivo. Tutto si fonda su un fatto semplice — l’area del picco è proporzionale alla quantità di analita — e su uno strumento di calcolo: la retta di taratura.

Vediamo perché l’area del picco misura la quantità, come si costruisce e si usa una retta di taratura, qual è la differenza fra standard esterno e interno e cosa si intende per intervallo di linearità.

L’area del picco misura la quantità

Il rivelatore registra un picco per ogni analita; la sua area (l’integrale del segnale nel tempo) è proporzionale alla quantità di analita passata. Più sostanza è presente, più alto e ampio è il picco, più grande è l’area. Si preferisce l’area all’altezza perché è meno sensibile a piccole variazioni nella forma del picco. È questa proporzionalità a rendere possibile la misura quantitativa.

A = area del picco  ∝  c (concentrazione dell’analita)

La proporzionalità diretta fra area e concentrazione è la base di tutto: se si conosce la costante di proporzionalità, da un’area misurata si risale alla concentrazione. Quella costante si determina sperimentalmente con la taratura.

La retta di taratura

Per quantificare si costruisce una retta di taratura: si preparano alcune soluzioni standard a concentrazione nota e crescente dell’analita, si analizzano e si riporta in grafico l’area del picco in funzione della concentrazione. I punti si dispongono lungo una retta, di cui si determina l’equazione per regressione lineare. A questo punto, misurando l’area di un campione incognito, dall’equazione della retta si ricava la sua concentrazione.

La qualità della taratura si giudica dal coefficiente di correlazione (vicino a 1) e dalla distribuzione casuale dei punti attorno alla retta. Un buon laboratorio prepara gli standard con cura, copre l’intervallo di concentrazioni atteso e ripete periodicamente la taratura, perché la risposta dello strumento può variare nel tempo.

Standard esterno e standard interno

Esistono due strategie principali di quantificazione. Con lo standard esterno si confronta direttamente l’area del campione con la retta costruita su standard analizzati separatamente: è semplice, ma sensibile a piccole variazioni nel volume iniettato o nella risposta dello strumento. Con lo standard interno si aggiunge a ogni campione e a ogni standard una quantità nota di una sostanza di riferimento (l’analita interno), e si lavora sul rapporto fra l’area dell’analita e quella dello standard interno. Eventuali errori di iniezione o di risposta agiscono su entrambi i picchi e si annullano nel rapporto, rendendo la misura più precisa.

L’intervallo di linearità

La proporzionalità fra area e concentrazione vale solo entro un certo intervallo di linearità: al di sotto, vicino al limite di rivelabilità, il segnale è confuso col rumore; al di sopra, a concentrazioni troppo alte, il rivelatore «satura» e la risposta non cresce più in modo proporzionale. La quantificazione è affidabile solo dentro questo intervallo, che va determinato e dichiarato in fase di validazione del metodo. Un campione la cui area cade fuori dall’intervallo va diluito (o concentrato) per riportarlo nella zona lineare.

Perché conta nella pratica

La quantificazione è il lavoro quotidiano dell’HPLC nel controllo qualità: stabilire il titolo di un prodotto, misurare un’impurezza entro i limiti, dosare un additivo. Per un tecnico, padroneggiare l’area del picco, la retta di taratura e la scelta fra standard esterno e interno significa produrre dati affidabili e difendibili, alla base di ogni decisione di accettazione o rifiuto di un lotto. Conoscere l’intervallo di linearità — e ricordarsi di diluire i campioni troppo concentrati — evita l’errore più insidioso: fidarsi di un risultato calcolato fuori dalla zona in cui il metodo è valido.

Domande frequenti

Perché si usa l’area del picco e non l’altezza per quantificare?

Perché l’area, cioè l’integrale del segnale nel tempo, è proporzionale alla quantità di analita ed è più robusta dell’altezza rispetto a piccole variazioni nella forma del picco, dovute per esempio a lievi differenze di flusso o di colonna. L’altezza può cambiare se il picco si allarga o si stringe; l’area resta più stabile, e per questo è la grandezza preferita nella quantificazione.

Come si costruisce una retta di taratura?

Si preparano soluzioni standard a concentrazione nota e crescente dell’analita, si analizzano in HPLC e si riporta in grafico l’area del picco in funzione della concentrazione. I punti si allineano su una retta, di cui si determina l’equazione per regressione lineare. Misurando poi l’area di un campione incognito, dall’equazione della retta si calcola la sua concentrazione.

Qual è la differenza fra standard esterno e standard interno?

Con lo standard esterno si confronta l’area del campione con una retta costruita su standard analizzati separatamente: semplice ma sensibile a variazioni di iniezione e di risposta. Con lo standard interno si aggiunge a campioni e standard una sostanza di riferimento nota e si lavora sul rapporto delle aree, così gli errori comuni si annullano nel rapporto e la misura è più precisa.

Che cos’è l’intervallo di linearità?

È l’intervallo di concentrazioni entro cui l’area del picco è proporzionale alla concentrazione dell’analita. Al di sotto, il segnale si confonde col rumore; al di sopra, il rivelatore satura e la risposta non cresce più in modo proporzionale. La quantificazione è affidabile solo dentro questo intervallo, che va determinato e dichiarato durante la validazione del metodo.

Cosa faccio se l’area di un campione è troppo alta?

Se l’area cade sopra l’intervallo di linearità, dove il rivelatore satura, il risultato non è affidabile: il campione va diluito con cura (con un fattore di diluizione noto) e rianalizzato, in modo che la nuova area rientri nella zona lineare. Solo lì il calcolo dalla retta di taratura è valido. Allo stesso modo, un campione troppo diluito va concentrato per superare il limite di rivelabilità.