La legge di Beer-Lambert in pratica e le sue deviazioni

La legge di Beer-Lambert è il ponte fra ciò che lo spettrofotometro misura e ciò che interessa al laboratorio: la concentrazione. In poche parole dice che l’assorbanza di una soluzione cresce in modo proporzionale a quanto è concentrata. È il fondamento di quasi tutta l’analisi quantitativa in UV-Vis, ma vale solo entro certi limiti, e conoscere le sue deviazioni è tanto importante quanto conoscere la legge stessa.

Vediamo che cosa sono assorbanza e trasmittanza, che cosa dice la legge di Beer-Lambert, come si costruisce una retta di taratura e quali sono le deviazioni che possono falsare un dosaggio.

Assorbanza e trasmittanza

Quando la luce attraversa una soluzione, una parte viene assorbita e il resto esce. La trasmittanza T è la frazione di luce che passa, rapporto fra l’intensità uscente e quella entrante; spesso si esprime in percentuale. L’assorbanza A è il logaritmo negativo della trasmittanza: A = −log T. È una grandezza adimensionale, comoda perché, a differenza della trasmittanza, cresce linearmente con la concentrazione. Una trasmittanza del 100% corrisponde ad assorbanza zero (nessun assorbimento); una trasmittanza del 10% corrisponde ad assorbanza 1.

A = ε · b · c     A = −log T

Le due relazioni cardine sono A = ε·b·c e A = −log T. Nella prima, ε (epsilon) è l’assorbività molare, b il cammino ottico (lo spessore della cella, di norma 1 cm) e c la concentrazione molare. L’assorbanza è dunque il prodotto di tre fattori: quanto la sostanza assorbe per sua natura, quanto cammino fa la luce nel campione e quanto la sostanza è concentrata.

L’assorbività molare

L’assorbività molare ε è una costante caratteristica della sostanza a una data lunghezza d’onda: misura quanto intensamente quella sostanza assorbe. Un cromoforo con π→π* permessa può avere ε di decine di migliaia, mentre una n→π* proibita ha ε di poche decine. Più alto è ε, più sensibile sarà il dosaggio: a parità di concentrazione si ottiene un’assorbanza maggiore, quindi si possono misurare quantità più piccole.

La retta di taratura

In pratica non si calcola la concentrazione dalla formula con un ε tabulato, ma si costruisce una retta di taratura: si preparano alcuni standard a concentrazione nota, si misura l’assorbanza di ciascuno e si riportano i punti su un grafico A contro c. Secondo Beer-Lambert i punti si allineano su una retta passante per l’origine, la cui pendenza è ε·b. Dalla retta, misurando l’assorbanza di un campione incognito, si ricava la sua concentrazione per interpolazione.

La retta di taratura è valida solo entro un intervallo di linearità, di norma per assorbanze comprese all’incirca fra 0,1 e 1,0. Sotto questo intervallo il segnale è troppo vicino al rumore; sopra, la legge devia e la retta si incurva. Per questo i campioni troppo concentrati si diluiscono fino a rientrare nell’intervallo, dove la misura è affidabile.

Le deviazioni dalla legge

Beer-Lambert è una legge limite: vale per soluzioni diluite e in condizioni ideali. Nella pratica esistono diverse cause di deviazione, che fanno perdere la proporzionalità fra assorbanza e concentrazione e curvare la retta di taratura.

Lavorare nella zona giusta

Tradotto in regole operative: misurare alla lunghezza d’onda del massimo di assorbimento (dove la curva è piatta e l’errore minore), tenere l’assorbanza nell’intervallo lineare diluendo i campioni concentrati, usare standard preparati nella stessa matrice del campione e verificare periodicamente la retta di taratura. Così la legge di Beer-Lambert restituisce concentrazioni affidabili, ed è questa affidabilità che rende l’UV-Vis uno dei pilastri dell’analisi quantitativa di routine.

Perché conta nella pratica

La legge di Beer-Lambert è lo strumento quotidiano di chi fa dosaggi quantitativi: dalla determinazione di un principio attivo al controllo di un colorante, dalla misura di un inquinante al titolo di una soluzione. Saper costruire e validare una retta di taratura, riconoscere quando un campione esce dall’intervallo lineare e capire perché un’assorbanza alta è inaffidabile sono competenze che fanno la differenza fra un dato corretto e uno falsato. Conoscere le deviazioni evita errori sistematici che nessuna ripetizione della misura potrebbe correggere.

Domande frequenti

Che cosa dice la legge di Beer-Lambert?

Dice che l’assorbanza di una soluzione è proporzionale alla concentrazione della sostanza assorbente, secondo A = ε·b·c, dove ε è l’assorbività molare, b il cammino ottico e c la concentrazione. In pratica, raddoppiando la concentrazione raddoppia l’assorbanza, finché si resta in condizioni diluite. È il fondamento dell’analisi quantitativa in UV-Vis.

Qual è la differenza fra assorbanza e trasmittanza?

La trasmittanza T è la frazione di luce che attraversa il campione (intensità uscente su entrante), spesso in percentuale. L’assorbanza A è il suo logaritmo negativo, A = −log T, ed è adimensionale. La trasmittanza varia in modo esponenziale con la concentrazione, l’assorbanza in modo lineare: per questo nei calcoli quantitativi si usa l’assorbanza.

Che cos’è l’assorbività molare?

È una costante caratteristica della sostanza a una data lunghezza d’onda, misurata in L·mol⁻¹·cm⁻¹, che indica quanto intensamente quella sostanza assorbe la luce. Valori alti, di migliaia o decine di migliaia, corrispondono a transizioni permesse e a dosaggi molto sensibili; valori bassi, di poche decine, a transizioni proibite. Nella legge di Beer-Lambert è il fattore ε.

Perché la legge devia alle concentrazioni alte?

Per più motivi. A concentrazione alta le molecole interagiscono fra loro e cambiano l’assorbività effettiva; possono intervenire equilibri chimici che modificano la specie assorbente; e cresce l’effetto della luce diffusa dello strumento, che fa apparire l’assorbanza più bassa del reale. Per questo si lavora con assorbanze entro circa 1,0 e si diluiscono i campioni troppo concentrati.

Come si costruisce una retta di taratura?

Si preparano diversi standard a concentrazione nota della sostanza da dosare, si misura l’assorbanza di ciascuno alla lunghezza d’onda scelta e si riportano i punti su un grafico assorbanza contro concentrazione. Secondo Beer-Lambert i punti si allineano su una retta che passa per l’origine; misurando l’assorbanza di un campione incognito e interpolandola sulla retta si ricava la sua concentrazione.