Spettroscopia UV-Visibile e legge di Beer-Lambert

La spettroscopia UV-Visibile è una delle tecniche più semplici, rapide ed economiche del laboratorio chimico, e per questo una delle più usate per la quantificazione: misura quanta luce, nell’ultravioletto e nel visibile, una sostanza assorbe. Da quella misura, grazie alla legge di Beer-Lambert, si risale direttamente alla concentrazione.

Vediamo che cosa succede a livello molecolare, come si legge uno spettro, la legge di Beer-Lambert con i suoi limiti, e come si imposta un’analisi quantitativa affidabile nel controllo qualità.

Che cosa misura

Quando una molecola viene colpita da radiazione ultravioletta o visibile, alcuni elettroni assorbono energia e passano a livelli energetici superiori: sono le transizioni elettroniche. La quantità di luce assorbita, e a quali lunghezze d’onda, dipende dalla struttura della molecola.

Lo spettro di assorbimento

Il risultato della misura è lo spettro: l’assorbanza in funzione della lunghezza d’onda. La posizione del massimo, indicata con λ_max, è caratteristica della sostanza e si sceglie come lunghezza d’onda di lavoro perché lì la sensibilità è massima e l’errore minimo.

La legge di Beer-Lambert

È la relazione che rende l’UV-Vis uno strumento quantitativo. L’assorbanza è direttamente proporzionale alla concentrazione:

A = ε · b · c

dove A è l’assorbanza (adimensionale), ε il coefficiente di estinzione molare (caratteristico della sostanza alla data lunghezza d’onda), b il cammino ottico della cuvetta (di norma 1 cm) e c la concentrazione. Poiché ε e b sono costanti, l’assorbanza diventa una misura diretta della concentrazione.

Trasmittanza e assorbanza

Lo strumento in realtà misura la trasmittanza T, cioè la frazione di luce che attraversa il campione, e la converte in assorbanza:

A = −log₁₀ T = log₁₀ I₀I

dove I₀ è l’intensità della luce incidente e I quella trasmessa. È per questo che l’assorbanza è una scala logaritmica: un’assorbanza di 1 significa che passa il 10% della luce, un’assorbanza di 2 solo l’1%.

Analisi quantitativa: la retta di taratura

In pratica non ci si fida del solo ε tabulato: si costruisce una retta di taratura misurando l’assorbanza di soluzioni standard a concentrazione nota. La retta A contro c permette poi di ricavare la concentrazione di un campione incognito dalla sua assorbanza. È il metodo standard per dosare un colorante, un conservante, un principio attivo o un metallo complessato.

I limiti della legge di Beer-Lambert

La proporzionalità non vale sempre. Le deviazioni più comuni:

• concentrazioni elevate: oltre un certo valore le molecole interagiscono tra loro e la linearità si perde — per questo si lavora in un intervallo di assorbanza controllato;
• luce diffusa (stray light) e radiazione non perfettamente monocromatica: appiattiscono la curva alle alte assorbanze;
• fenomeni chimici: equilibri, dissociazione o aggregazione che cambiano la specie assorbente al variare della concentrazione.

Strumentazione in breve

Uno spettrofotometro UV-Vis ha una sorgente (lampada al deuterio per l’UV, al tungsteno per il visibile), un monocromatore che seleziona la lunghezza d’onda, il vano cuvetta e un rivelatore. Gli strumenti a serie di diodi acquisiscono l’intero spettro in un istante e sono comodissimi per il controllo di routine.

Singolo raggio e doppio raggio

Gli spettrofotometri si dividono in due famiglie. Quelli a singolo raggio misurano prima il bianco e poi il campione: sono economici ma sensibili alle derive della lampada nel tempo. Quelli a doppio raggio dividono il fascio e misurano contemporaneamente bianco e campione, compensando in tempo reale le fluttuazioni della sorgente: sono più stabili e adatti alle scansioni di spettro. Gli strumenti a serie di diodi (PDA), infine, acquisiscono tutte le lunghezze d’onda in un istante, ideali quando si analizzano molti campioni in routine.

Dove si usa nel controllo qualità

La combinazione di semplicità, costo basso e buona precisione rende l’UV-Vis una delle tecniche più trasversali del laboratorio. Alcune applicazioni tipiche:

In molti casi l’analita non assorbe di per sé: lo si fa reagire con un reattivo che forma un complesso colorato (metodo colorimetrico), e si misura quello. È così che si dosano molti ioni inorganici incolori.

Errori comuni da evitare

Oltre alle cuvette sporche, i tre errori più frequenti sono: lavorare fuori dall’intervallo lineare (campione troppo concentrato, da diluire); usare un bianco che non riproduce esattamente la matrice del campione; e trascurare la temperatura, che per alcuni analiti sposta l’assorbanza. Una buona prassi è rimisurare uno standard a metà sequenza per controllare che lo strumento non sia derivato.

Oltre la singola misura: cinetiche e scansioni

L’UV-Vis non serve solo a misurare un punto. Tenendo fissa la lunghezza d’onda e registrando l’assorbanza nel tempo si seguono le cinetiche di una reazione, utile per studiare la stabilità di un prodotto o la velocità di degradazione di un attivo. Acquisendo invece l’intero spettro (scansione) si confronta il profilo del campione con quello di riferimento: un modo rapido per verificare che una materia prima sia quella attesa e non presenti assorbimenti anomali da contaminanti. Molti strumenti permettono anche misure a piu’ lunghezze d’onda contemporanee, alla base dei metodi multicomponente che dosano piu’ sostanze in un solo spettro.

UV-Vis e conformità

Nel controllo qualità l’UV-Vis serve a dosare conservanti, coloranti, principi attivi e contaminanti: dati che confluiscono nei certificati di analisi e, quando rilevanti, nella composizione dichiarata in scheda dati di sicurezza. È una tecnica a basso rischio, ma i solventi delle misure restano rifiuti chimici da gestire.

Vedi anche. Allo stesso scopo analitico concorrono altre tecniche ottiche di laboratorio: la misura dell’indice di rifrazione (rifrattometria) e quella del potere rotatorio in polarimetria.

Una tecnica anche piu sensibile dell’assorbimento e la spettrofluorimetria.

Domande frequenti

Perché si misura a λ_max?

Perché in quel punto l’assorbanza è massima (massima sensibilità) e la curva è piatta: un piccolo errore nella selezione della lunghezza d’onda incide pochissimo sul risultato, rendendo la misura più riproducibile.

Qual è l’intervallo di assorbanza ideale?

Indicativamente tra 0,1 e 1,0. Sotto, il segnale è troppo debole rispetto al rumore; sopra, si esce facilmente dalla linearità della legge di Beer-Lambert. Se il campione è troppo concentrato, si diluisce.

A che cosa serve il bianco?

Il bianco contiene tutto tranne l’analita (di norma il solo solvente) e serve ad azzerare lo strumento, in modo che l’assorbanza misurata sia attribuibile solo alla sostanza di interesse e non al solvente o alla cuvetta.

Che differenza c’è tra assorbanza e trasmittanza?

La trasmittanza è la frazione di luce che passa (scala lineare, in %); l’assorbanza è il suo logaritmo cambiato di segno (scala logaritmica). Si usa l’assorbanza perché è quella proporzionale alla concentrazione.

L’UV-Vis identifica una sostanza sconosciuta?

Non da sola: gli spettri UV-Vis sono larghi e poco specifici. È ottima per quantificare una sostanza nota, ma per l’identificazione servono tecniche come IR, NMR o la spettrometria di massa.