Recupero e prove di recupero

Dire che un metodo è accurato sul solo standard puro non basta: il campione reale ha una matrice — sangue, suolo, alimento, formulato — che può trattenere, distruggere o mascherare l’analita durante la preparazione. La prova di recupero misura quanta parte dell’analita il metodo riesce davvero a ritrovare nella matrice, ed è il modo più diretto per dimostrare l’accuratezza in condizioni reali.

Vediamo che cos’è il recupero, come si esegue una prova con aggiunta nota (spike), come si calcola la percentuale di recupero, che cos’è l’effetto matrice e quali intervalli sono considerati accettabili.

Perché serve provare il recupero

Tra la concentrazione realmente presente in un campione e quella che lo strumento misura si frappongono molti passaggi: estrazione, purificazione, concentrazione, diluizione. In ognuno l’analita può andare in parte perduto — adsorbito su un filtro, evaporato, non completamente estratto — oppure subire un’interferenza che ne altera la risposta. Il recupero quantifica l’effetto netto di tutta questa procedura: idealmente vale il 100%, cioè il metodo ritrova tutto ciò che è stato aggiunto. Senza questa verifica, l’accuratezza dimostrata sugli standard puri resta una promessa non mantenuta: lo standard sciolto in solvente non subisce le perdite e le interferenze che il campione reale impone, e un metodo impeccabile in provetta può perdere metà dell’analita appena messo alla prova su una matrice complessa.

La prova con aggiunta nota (spike)

La tecnica standard è l’aggiunta nota, o spike: a un campione di matrice si aggiunge una quantità precisa e nota di analita, poi si processa il campione con l’intera procedura analitica e si misura quanto se ne ritrova. Confrontando la concentrazione trovata con quella attesa si ricava il recupero. È fondamentale eseguire lo spike sulla matrice reale, non sul solvente, perché è proprio la matrice ciò che si vuole mettere alla prova.

Il calcolo della percentuale di recupero

Il recupero si calcola confrontando la concentrazione misurata nel campione addizionato con quella del campione non addizionato, rapportata alla quantità aggiunta. La sottrazione del campione non addizionato serve a scontare l’analita eventualmente già presente nella matrice.

Recupero = C_trovata − C_campioneC_aggiunta · 100  (%)

Un recupero del 100% indica che il metodo ritrova esattamente l’analita aggiunto. Valori inferiori segnalano perdite (estrazione incompleta, adsorbimenti, degradazione); valori superiori al 100% segnalano in genere un’interferenza positiva o una contaminazione. In entrambi i casi il dato va indagato: un recupero stabile ma diverso dal 100% può essere corretto con un fattore, ma un recupero erratico indica un metodo non sotto controllo.

L’effetto matrice

L’effetto matrice è l’influenza dei componenti del campione diversi dall’analita sulla risposta del metodo. Può sopprimere il segnale — tipico in spettrometria di massa con sorgente a elettrospray — o esaltarlo, e cambia da matrice a matrice. È la ragione principale per cui un metodo validato su una matrice non è automaticamente valido su un’altra, e per cui le prove di recupero vanno ripetute quando cambia il tipo di campione. Per neutralizzarlo si ricorre a tarature in matrice, a standard interni o al metodo delle aggiunte multiple.

Gli intervalli accettabili

Non esiste un unico criterio: l’intervallo di recupero accettabile dipende dal livello di concentrazione e dal tipo di analisi. Per analiti a concentrazione elevata si pretende un recupero molto vicino al 100%; per le analisi in tracce si accettano fasce molto più larghe, perché perdite e interferenze sono inevitabilmente maggiori.

Perché conta nella pratica

Per chi lavora nel controllo qualità, la prova di recupero è il ponte fra il laboratorio e la realtà del campione. Un metodo che funziona bene sugli standard puri può fallire clamorosamente su una matrice complessa, e senza prove di recupero questo fallimento resta invisibile fino a quando un risultato sbagliato non causa un problema. Eseguire lo spike sulla matrice giusta, su più livelli e in replica, e indagare ogni recupero fuori intervallo, è ciò che garantisce che il numero riportato corrisponda davvero a quanto c’è nel campione.

Domande frequenti

Che cos’è il recupero in un metodo analitico?

È la frazione di analita che il metodo riesce a ritrovare rispetto alla quantità realmente presente o aggiunta al campione, espressa in percentuale. Misura l’effetto combinato di estrazione, preparazione e matrice sull’accuratezza: un recupero del 100% indica che il metodo ritrova tutto l’analita, valori inferiori indicano perdite e valori superiori interferenze o contaminazioni.

Come si esegue una prova di recupero?

Con la tecnica dell’aggiunta nota, o spike: si aggiunge a un campione di matrice una quantità precisa e nota di analita, si processa il campione con l’intera procedura analitica e si misura quanto se ne ritrova. È essenziale eseguire lo spike sulla matrice reale e non sul solvente, perché lo scopo è proprio verificare l’effetto della matrice sull’accuratezza.

Come si calcola la percentuale di recupero?

Si rapporta alla quantità aggiunta la differenza fra la concentrazione trovata nel campione addizionato e quella del campione non addizionato: recupero = (C trovata − C campione) / C aggiunta, in percentuale. Sottrarre il campione non addizionato serve a scontare l’analita già presente nella matrice. Il valore ideale è 100%.

Che cos’è l’effetto matrice?

È l’influenza dei componenti del campione diversi dall’analita sulla risposta del metodo: può sopprimere o esaltare il segnale e varia da una matrice all’altra. È il motivo per cui un metodo validato su una matrice non è automaticamente valido su un’altra. Si neutralizza con tarature in matrice, standard interni o il metodo delle aggiunte multiple.

Quale recupero è considerato accettabile?

Dipende dal livello di concentrazione: per analiti a concentrazione elevata si pretende circa 98-102%, mentre in tracce si accettano fasce più larghe, anche 70-120% vicino al limite di quantificazione, perché perdite e interferenze pesano di più. Le prove vanno eseguite ad almeno tre livelli e in replica, per valutare sia l’accuratezza media sia la precisione del recupero.